[发明专利]一种用于制备人细胞因子诱导的杀伤细胞的融合蛋白

权利要求书

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为人细胞间粘附分子-l功能结构域和人纤连蛋白功能结构域的融合蛋白，且所述人细胞间粘附分子-1功能结构域包含人细胞间粘附分子-1胞外第I、II结构域，所述人纤连蛋白功能结构域包含人纤连蛋白的细胞结合域、肝磷脂域和CS-1结构域。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白中人细胞间粘附分子-1功能结构域与人纤连蛋白功能结构域是通过柔性肽连接；

优选地，所述柔性肽氨基酸序列为SEQ ID NO: l。

3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的DNA序列如SEQ ID NO: 2所示。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白在制备人细胞因子诱导的杀伤细胞中的用途。

5.一种人细胞因子诱导的杀伤细胞，其特征在于，所述杀伤细胞通过包括以下步骤的制备方法制得：

在人细胞因子诱导的杀伤细胞的前体细胞培养前，用含有有效量的根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白和人CD3单克隆抗体的包被液包被细胞培养瓶。

6.根据权利要求5所述的杀伤细胞，其特征在于，所述制备方法还包括以下步骤：在所述人细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导及培养全过程中，在细胞培养液中添加人CD3单克隆抗体；并且所述人CD3单克隆抗体在所述细胞培养液中的浓度低于在所述包被液中的浓度。

7.根据权利要求5或6所述的杀伤细胞，其特征在于，所述制备方法包括：

1）用有效量的重组ICAM-FN和人CD3单克隆抗体包被细胞培养瓶，然后用该细胞培养瓶培养经分离得到的人外周血单个核细胞；

2）在所述人外周血单个核细胞培养过程中，于细胞培养液中加入人CD3单克隆抗体进行持续刺激，且人CD3单克隆抗体在细胞培养液中的浓度小于所述包被液中的浓度；和

3）检测由诱导人外周血单个核细胞得到的CIK细胞的各项指标；

优选地，在所述包被液中，所述融合蛋白浓度为5-25μg/ml，优选浓度为10-15μg/ml，所述人CD3单克隆抗体的浓度为1-10μg/ml，优选浓度为4-7μg/ml，最优选浓度为5μg/ml；在所述细胞培养液中，所述人CD3单克隆抗体的浓度为50-100ng/ml。

8.一种人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

在人细胞因子诱导的杀伤细胞的前体细胞培养前，用含有有效量的根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白和人CD3单克隆抗体的包被液包被细胞培养瓶。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括以下步骤：在所述人细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导及培养全过程中，在细胞培养液中添加人CD3单克隆抗体；并且所述人CD3单克隆抗体在所述细胞培养液中的浓度低于在所述包被液中的浓度。

10.根据权利要求8或9所述的杀伤细胞，其特征在于，所述制备方法包括：

1）用有效量的重组ICAM-FN和人CD3单克隆抗体包被细胞培养瓶，然后用该细胞培养瓶培养经分离得到的人外周血单个核细胞；

2）在所述人外周血单个核细胞培养过程中，于细胞培养液中加入人CD3单克隆抗体进行持续刺激，且人CD3单克隆抗体在细胞培养液中的浓度小于所述包被液中的浓度；和

3）检测由诱导人外周血单个核细胞得到的CIK细胞的各项指标；

优选地，在所述包被液中，所述融合蛋白浓度为5-25μg/ml，优选浓度为10-15μg/ml，所述人CD3单克隆抗体的浓度为1-10μg/ml，优选浓度为4-7μg/ml，最优选浓度为5μg/ml；在所述细胞培养液中，所述人CD3单克隆抗体的浓度为50-100ng/ml。