[发明专利]一种短短芽孢杆菌菌株胞内物质提取的超声波破碎方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种生物领域的超声破碎方法，尤其涉及一种短短芽孢杆菌菌株胞内物质提取的超声波破碎方法。

【背景技术】

短短芽孢杆菌是一类革兰氏染色阳性或可变、菌体杆状、以周生鞭毛运动、产芽孢的一类细菌。本申请人已于2010年09月29日申请的中国发明申请号为CN201010296437.6、名称为“一种新的短短芽孢杆菌菌株及其应用”中揭露了“短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX”，其于2010年08月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且保藏编号为CGMCC No.4115；该短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX（Brevibacillus brevis FJAT-0809-GLX）是从福建省永泰县的西瓜根际土壤中分离并筛选得到具有拮抗作用的菌株，该菌对大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）、黑白轮枝菌（Verticillium alboatrum）、真菌轮枝霉（Verticilium fungicola）、胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）、桃褐腐丛梗孢（Monilialaxa）和青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）等多种病原菌显示出较强的拮抗活性（记载于葛慈斌等.2009.福建农业学报，24（1）：29-34）。目前普遍认为，短短芽孢杆菌的抑菌机理主要是菌体可以产生短杆菌肽和几丁质酶等活性物质。短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX胞外物质具有较强的稳定性，胞外物质于60-80℃温育1h抑菌活性保持在88.5%以上，在酸性pH3.0-5.0和碱性pH9.0-10.0条件下，抑菌活性保持在77.2%以上，对蛋白酶K、光照、紫外照射等均不敏感（记载于郝晓娟等，2007.浙江大学学报（农业与生命科学版），33（5）：484-489）。

胞内物质的种类与细胞的生理代谢密切相关，短短芽孢杆菌FJAT-0809-GLX胞外物质特性已有报道，但胞内物质研究还未见报道。研究胞内物质第一步是进行细胞破碎，短短芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，其细胞壁较厚，肽聚糖网状结构较致密，破碎具有一定的难度。目前广泛采用的菌株的破碎方法有高速匀浆法、高速珠磨法、酶学法、化学渗透法、微波细胞破碎、超声波细胞破碎等，各种方法都有其的适用范围和优缺点。其中，超声波细胞破碎方法的超声波频率高、波长短，因此在一定距离内具有较强的方向性和穿透性，易于获得较集中的声能，利于细胞破碎；超声波的作用机制主要包括热学机制、机械粉碎机制、空化作用和化学效应。超声波辅助提取法在中草药有效成分的提取和分离应用广泛，但超声波细胞破碎法提取短短芽孢杆菌菌株胞内物质的研究还未见报道。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题在于提供一种破碎率高的短短芽孢杆菌菌株胞内物质提取的超声波破碎方法。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种短短芽孢杆菌菌株胞内物质提取的超声波破碎方法，该方法具体包括如下步骤：

步骤一：将短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的种子液按1%比例接种于装有LB液体培养基的发酵罐中，30℃下发酵48h；

步骤二：将步骤一获得的发酵液置于6000rpm/min离心15min，弃上清，收集菌体，并用超纯水反复洗涤菌体4次；

步骤三：将步骤二最终收集的菌体与超纯水混合，置于超声波细胞破碎仪中进行细胞破碎；且细胞破碎的条件为：超声波功率为318.68W；超声时间0.5s，间歇时间1.5s，循环进行且超声总历时10min；料液比（即最终所收集菌体与超纯水的比例）为1:25；

步骤四：利用乙酸乙酯萃取步骤三细胞破碎后所得的菌体悬浮液，之后将所得萃取液进行旋转蒸发以获得胞内物质干重。

进一步地，所述LB液体培养基的组分为：胰蛋白胨1%，牛肉浸膏0.5%，NaCl0.5%，超纯水配制，pH7.0-7.2；且该培养基组分的百分比为质量百分比。

本发明的有益效果在于：提供了一种短短芽孢杆菌菌株胞内物质提取的超声波破碎方法，填补了现有技术中对短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX胞内物质提取的空白，尤其是其超声波破碎方面的空白；且本发明还具有破碎率高的特点，能够极大地提高所获得短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX胞内物质的量。

【附图说明】

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。

图1是本发明中响应面法（超声波功率、料液比）等高线分析图。