[发明专利]双启动子双表达特异性shRNA慢病毒载体及其应用

权利要求书

1.一种能够同时表达出两种shRNA的慢病毒载体，其特征为包含核苷酸序列为SEQ ID NO:1的U6启动子和核苷酸序列为SEQ ID NO:2的H1启动子。

2.权利要求1所述的慢病毒载体，其特征为包含SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的双启动子区。

3.权利要求1或2所述的慢病毒载体，其特征为：

1）U6启动子启动的shRNA引入酶切位点为BamHI和EcoRI，分别位于SEQ ID NO:3中253-258位和262-267位；

2）H1启动子启动的shRNA引入酶切位点为XbaI和XhoI，分别位于SEQ ID NO:3中483-488位和SEQ ID NO:3中492-497位。

4.权利要求3所述的慢病毒载体，其特征为：

1）在BamHI和EcoRI酶切位点插入了表达shRNA的双链DNA寡核苷酸，其正向序列和反向序列如oligo1(+)和oligo1(-)所示，退火后两段形成BamHI和EcoRI酶切粘性末端，通过U6启动子进行启动；

2）在XbaI和XhoI酶切位点插入了表达另外一种shRNA的双链寡核苷酸，其正向序列和反向序列如oligo2(+)和oligo2(-)所示，退火后两段形成XbaI和XhoI酶切粘性末端，由H1启动子进行启动；

所述Oligo1(+)序列是5’-gatcccc—N¹—ttcaagaga—M¹—tttttg-3’，其中N¹是长度为19～22bp的siRNA序列，M¹是N¹的反向互补序列；

所述Oligo1(-)5'-aattcaaaaa—N²—tctcttgaa—M²—ggg-3'，其中N²是长度为19～22bp的siRNA序列，M²是N²的反向互补序列；

所述Oligo2(+)5’-ctagacc—N³—ttcaagaga—M³—tttttc-3’，其中N³是长度为19～22bp的siRNA序列，M³是N³的反向互补序列；

所述Oligo2(-)5'-tcgagaaaaa—N⁴—tctcttgaa—M⁴—ggt-3'，其中N⁴是长度为19～22bp的siRNA序列，M⁴是N⁴的反向互补序列。

5.一种同时表达靶向HIV病毒中vpr基因和tat基因的慢病毒载体，其特征是包含SEQ ID NO:4～SEQ ID NO:7所示的shRNA。

6.权利要求1或5所述慢病毒载体在研制防治HIV感染药物中的应用。

7.权利要求6所述的应用，所述防治HIV感染药物是抑制vpr基因表达和/或下调tat基因的表达水平的药物。

8.一种构建shRNA双表达慢病毒表达质粒的方法，在多克隆位点引入含有BamHI-EcoRI-XbaI-XhoI的寡核苷酸序列；且在限制性酶切位点EcoRI和XbaI之间插入SEQ ID NO:2所示序列的H1启动子，形成SEQ ID NO：3所示序列的双启动子区；

所述BamHI、EcoRI、XbaI和XhoI如权利要求3所示；

所述BamHI-EcoRI-XbaI-XhoI的序列为5’-GGATTC GAATTC TCTAGA CTCGAG-3’。