[发明专利]层析滤纸型酶联免疫吸附测定

说明书

技术领域

本发明是关于一种层析滤纸型酶联免疫吸附测定，特别是运用于眼球血管病变分析的层析滤纸型酶联免疫吸附测定。

背景技术

随着社会的富裕，人民生命的延长，罹患糖尿病及视网膜黄斑部病变的病人却越来越多，后者目前已经在美国估计有一百万人以上罹病，两种疾病目前证实都跟眼球中的一种血管新生因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)浓度有着高度相关性，浓度越高，糖尿病视网膜病变或视网膜黄斑部病变就会越变越严重，甚至造成失明。

在上述两种疾病上的治疗，药物上目前是开发出两种抗血管新生因子的抗体，一是旧型的Bevacizumab(Avastin癌思停)，二是从旧型中改良为新型更小分子量的ragibizumab(1ucontis乐舒晴)，此两种药物目的皆是减少日即青中的血管新生因子浓度，来达到减少血管新生，停止视力的恶化。

然而在眼睛疾病检测方面，由于眼睛是一个特化的神经组织，一般的抽血检验方式是无法验出其病灶活性，目前也没有适当方便的方法去取得眼球内液体去分析其病灶相关因子的浓度，因此目前没有适当分子检验的方法来追踪眼睛内血管新生的浓度。

ELISA

酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是利用抗原和抗体特异性结合后，加入标记有酶的抗原或抗体，最后加入酶的受体，藉由酶作用受体产生显色物质，利用ELISA判读机判读实验结果。其中，显色反应的有无即可得知抗原和抗体有无结合，而达到定性的目的，另外，也可由显色反应颜色的深浅，可知抗原、抗体结合多寡而达到定量的目的。

传统ELISA通常是在96孔板(材质为射出成型的塑料)操作，其优点为可进行定量试验，并且适宜进行高通量试验。但是ELISA的每个试验所需分析物及试剂的体积相当大(大约20-200μl)，并且需要的时间长。因此仍有改良的空间。

DIA

斑点免疫结合试验(dot-immunobinding assays，DTA)是将使用于包含硝化纤维素及滤纸的多孔膜。虽然DTA可提供试纸上可进行的简单免疫检测，但通常每一个试验都需要个别一张硝化纤维素试纸，并且需要在培养皿之中个别处理，并且需数小时才能完成。目前大部分的斑点免疫结合试验仍为定性试验而非定量试验，而仅而提供“有／无”的结果。

斑点ELISA

公告号第US7，083，912号美国专利揭示一种用以检测病毒的斑点ELISA(Dot—ELISA)，其使用硝化纤维及单株抗体以提高检测灵敏度。但其主要为定性检测，仍无达成定量实验。

综合上述，到目前为止，使用传统式ELISA法以进行眼球前房的VEGF浓度监测是相当困难的，因此从眼球前房抽取的前房液最多为0.2mL，而96测试井的传统式ELISA每一个测试井都需要约0.1mL的前房液。因此，一个病人就是只能做一次传统式ELISA的检测(最多二次)，无法进行重复试验以获得高可信度的临床信息。因此，开发一种仅需小量样品而可快速、大量检测的方法，以分析眼球内液体中生长因子，是目前亟需努力的目标。

发明内容

本发明目的之一是提供一种层析滤纸型酶联免疫吸附测定方法，其具有进行样本量少、高灵敏度及快速分析的优势。

依据本发明的一实施例，一种层析滤纸型酶联免疫吸附测定方法，包括：提供一层析滤纸纸盘，其具有至少一疏水区以定义出独立的复数个亲水区；将一样本的一抗原固定于层析滤纸纸盘的亲水区之其一；以及利用一酶联免疫吸附测定方法检测抗原，其中酶联免疫吸附测定方式是使用一单株抗体。

附图说明

图1为一示意图显示本发明的层析滤纸型酶联免疫吸附测定的流程；其中SI-S3表示步骤。

图2为一图式显示本发明的一层析滤纸纸盘；其中，

l表示层析滤纸纸盘

11表示亲水区

l2表示疏水区。

图3A至3B为实验数据显示本发明的层析滤纸型酶联免疫吸附测定的灵敏度。

图4A至图4E为照片显示糖尿病视网膜病变患者的眼球血管病变情形。

图5A至图5F为照片显示老年性黄斑病变患者的眼球血管病变情形。

图6A至图6F为照片显示视网膜静脉阻塞患者的眼球血管病变情形。

图7A至图7B为照片分别显示年龄性黄斑病变患者治疗前后的眼球血管病变情形。

具体实施方式