[发明专利]优化的木霉几丁质酶基因和大豆葡聚糖酶基因和双元表达载体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及按玉米偏爱密码子合成木霉几丁质酶基因和大豆葡聚糖酶基因及其在培育抗病性玉米新品种中的应用，具体是一种优化的木霉几丁质酶基因和大豆葡聚糖酶基因和双元表达载体及其应用。 

背景技术

木霉是一类重要的植物病害生防菌，可强烈抑制纹枯病菌、镰刀菌等。几丁质酶主要是通过降解菌丝生长顶端新合成的几丁质而影响菌丝顶端的延伸，还可以使真菌的芽管和附属胞解体、细胞壁降解及芽管伸长受抑制。另外几丁质酶也可能参与了病原侵染后植物表面木质化的形成过程。Gonzalez研究指出,真菌细胞壁能有效诱导木霉几丁质酶的产生。木霉几丁质酶不仅能降解病原真菌成熟的菌丝顶端,同时也能降解具有几丁质-葡聚糖复合结构的细胞壁以及菌核。Lorito研究表明,木霉几丁质酶的生物防治效果要比植物、细菌和其它真菌的几丁质酶好,这进一步说明,对于木霉菌来说,这类酶应当是专门降解真菌细胞壁的。另外,Benhamou研究表明,木霉菌的几丁质酶不仅可以水解菌丝顶端的软组织,还可以水解成熟菌丝、分生孢子、厚垣孢子等“硬”的、含有几丁质的组织。Chet等表明,哈茨木霉和哈氏木霉能够产生β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶,从而引起寄主菌丝体的解体。从真菌的细胞壁组成分析，半子囊菌纲，卵菌纲，壶菌纲等真菌细胞壁最外层均覆盖有葡聚糖层,β-1,3-葡聚糖酶对这些表层的多糖水解后使内层的几丁质暴露出来，才能使几丁质酶发挥作用。许多实验表明，β-1,3-葡聚糖酶对真菌菌丝生长有抑制作用，其活性与植物抗病性之间存在很高的相关性.β-1,3-葡聚糖酶，在植物抗病反应中独立地发挥作用，但在植物整个抗病系统反应中，各种防卫反应往往表现出协同作用。体外试验表明，该酶与几丁质酶共同作用时能有效地抑制供试的18种真菌中的15种。正常情况下，β-1,3-葡聚糖酶基因在植物体内只有低水平的组成型表达。植物在病原真菌入侵后这些蛋白往往表达量不够，或表达期太晚，或由于病原真菌分泌蛋白对内源β-1,3-葡 聚糖酶的抑制等，以致不能使植物体免受病害。将外源β-1,3-葡聚糖酶基因导入植物，使其在体内超常表达可以增强植株抵御真菌病害的能力。目前己有多种葡聚糖酶基因被克隆了，这为其在植物抗病基因工程中的应用提供了必要的条件。Yoshikawa M发现转基因的烟草植株中P-1,3-葡聚糖酶活性为非转基因烟草植株的4倍，并且表现出对某些病原菌的良好抗性，Otsuka C等(1993)类似的实验表明转基因植株对黑胫病、赤星病及根腐病的病原菌均表现出增强的抗性。密码子的偏好性，是指整个生物界中虽然共用同一套遗传物质，即基于61个密码子，编码不同的20种基本氨基酸，然而在不同物种中对于编码同一氨基酸的碱基密码却有不同的使用频率，此即为密码子的偏好性。遗传密码采用61组三连核苷酸（密码子）编码20种氨基酸，采用3个密码子终止翻译。因此每个氨基酸利用1个（Met和Trp）至6个（Arg，Leu，和Ser）同义密码子编码。这些密码子在核糖体中被互补的tRNA阅读，而这些tRNA已经事先携带了相应的氨基酸。密码子的简并性使得同一蛋白可采用多种不同的核苷酸序列编码。对于两种不同的生物，或对于同一生物的不同表达基因，有时甚至在同一个操纵子内部，对不同密码子的使用频率其差异都可能很大。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种优化的木霉几丁质酶基因和大豆葡聚糖酶基因和双元表达载体及其应用。 

本发明的技术方案如下： 

一种优化的木霉几丁质酶基因和大豆葡聚糖酶基因，优化的木霉几丁质酶基因和大豆葡聚糖酶基因分别具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。 

包含所述的木霉几丁质酶基因和大豆葡聚糖酶基因的双元表达载体。 

所述的双元表达载体在培育抗病性玉米新品种中的应用。 

玉米纹枯病危害玉米近地面几节的叶鞘和茎杆，引起茎基腐败，破坏输导组织，影响水分和营养的输送，因此造成的损失较大，减产损失在10％－20％，严重的高达35％。本发明获得的两个基因通过转化玉米自交系，获得稳定且高表达的转基因材料，提高了抗纹枯病水平，降低了纹枯病对玉米生产造成的损失。 

附图说明

图1为载体pCAMBIA3301-glu经NcoⅠ和pmlⅠ双酶切鉴定； 

图2为载体pCAMBIA3301-ubi-glu经HindⅢ和BamHⅠ双酶切鉴定；