[发明专利]一种用于保存CIK细胞的冻存液及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于保存CIK细胞的冻存液及其应用。

背景技术

CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer cells），是一种非MHC限制性的高效溶肿瘤细胞毒性T淋巴细胞，在外周血淋巴细胞中的比例为1%-5%。1991年Schmidt-Wolf等首先报道了一类由多种细胞因子诱导的杀伤细胞，即CIK细胞。

目前，免疫细胞过继疗法已成为放、化疗后对肿瘤患者进行辅助治疗的重要手段之一，CIK细胞是过继治疗的主力军。通常采用自体外周血制备CIK，一方面CIK细胞数量不足，另一方面会加重患者体质虚弱，使机体处于免疫系统薄弱时期，易引起感染。脐血来源丰富，细胞增殖能力强，是较为理想的CIK细胞来源。因此，CIK细胞的保存技术很值得研究。CIK细胞培养周期较长，易污染，不利于其临床应用，因此寻找一种CIK细胞保存方法尤为重要。

人类的CIK细胞是一群异质性细胞群，已有研究证实CD3⁺CD56⁺细胞和CD8⁺杀伤T细胞是构成CIK细胞强大杀瘤活性的主要效应细胞。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于保存CIK细胞的冻存液及其应用。

本发明提供的用于保存CIK细胞的冻存液，是按照如下方法制备得到的：在淋巴细胞无血清培养基中加入二甲基亚砜和右旋糖苷，使二甲基亚砜的体积百分含量为5-15%（如5-10%、10-15%、5%、10%或15%），使右旋糖苷的体积百分含量为5-15%（如5-10%、10-15%、5%、10%或15%）。

所述淋巴细胞无血清培养基具体可为GT-T551，具体可为购自日本TAKARA BIO INC货号为GT-T551的GT-T551培养液。

本发明提供的冻存液中，添加了右旋糖苷作为细胞外的非渗透性保护物质，在冷冻过程中可减少细胞内冰晶的形成，复苏时还可以减轻由于渗透压的改变而引起的细胞肿胀。本发明发现，右旋糖苷与DMSO的联合使用能发挥叠加或协调低温保护作用。右旋糖苷输注在临床上原本就被用于扩充血容量，且目前未发现对人体有副作用。

本发明还保护所述冻存液在保存CIK细胞中的应用。

本发明还保护一种保存CIK细胞的方法，包括如下步骤：用所述冻存液悬浮CIK细胞，得到细胞悬液，然后冷冻保存所述细胞悬液。

所述方法中，所述细胞悬液中的细胞浓度可为10⁸个细胞/ml的细胞悬液。

所述冷冻保存的步骤可为：将所述细胞悬液采用程控降温仪降温后置于液氮中保存。所述程控降温仪的降温参数可为：4℃～-40℃，1～2℃/每分钟；-40℃～-80℃，10℃/每分钟。在液氮中保存的时间具体可为180天以内。

与冻存前的细胞相比，采用本发明提供的冻存液冻存后的细胞：（1）细胞形态无明显差异；（2）免疫表型（CD3⁺CD56⁺和CD8⁺）无明显差异；（3）细胞增殖活力、细胞杀伤活性无明显差异。结果表明，本发明提供的冻存液显著优于传统冻存液。

附图说明

图1为实施例2中冻存前的细胞和复苏后的细胞在倒置显微镜下的照片（×200）。

图2为实施例2中各组CIK细胞的一次流式检测结果。

图3为实施例2中各组细胞的生长曲线。

图4为实施例2中各组CIK细胞的细胞毒性比较。

图5为实施例3中冻存前的细胞和复苏后的细胞在倒置显微镜下的照片（×200）。

图6为实施例3中各组CIK细胞的一次流式检测结果。

图7为实施例3中各组细胞的生长曲线。

图8为实施例3中各组CIK细胞的细胞毒性比较。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中的统计学方法均为用SPSS10.0软件进行t检验和方差分析。

K562细胞（人慢性髓系白血病细胞）：购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心，资源编号：3111C0001CCC000039。