[发明专利]一种含有能够降解苯并[a]芘基因的降解质粒

权利要求书

1.一种含有能够降解苯并[a]芘基因的降解质粒，其特征在于，该降解质粒由产碱菌Alcaligenes sp.的菌液经过提取与纯化得到的，产碱菌Alcaligenes sp.的菌种保藏号为CGMCCNo.3638，其中，从产碱菌Alcaligenes sp.中提取与纯化含有能够降解苯并[a]芘基因的降解质粒的具体方案为：

(1)向体积为500mL的锥形瓶内加入400mL基础培养基、1.0mL微量金属液、0.1mL维生素c溶液，摇匀后作为液体培养基备用；其中基础培养基的组成为：NH₄NO₃：1.7g·L^-1，KH₂PO₄：1.0g·L^-1，K.₂HPO₄：1.0g·L^-1，MgCl₂：0.30g·L^-1，CaCl₂·2H₂O：0.15g·L^-1；微量金属液的组成为：CoCl₂·6H₂O：55mg·L^-1，CuCl₂：0.35mg·L^-1，H₃BO₃：11.0mg·L^-1，MnCl₂·4H₂O：45mg·L^-1，Na₂MoO₄·2H₂O：5.5mg·L^-1，NiCl₂·2H₂O：4.5mg·L^-1，ZnCl₂：4.5mg·L^-1；

(2)在超净工作台中向体积为100mL的锥形瓶中加入6.0mL浓度为1g/L的苯并[a]芘丙酮溶液，为除去丙酮将锥形瓶开口放置2天；

(3)向步骤(2)中的锥形瓶内加入60mL按步骤(1)配制的液体培养基；

(4)在超净工作台中挑取产碱菌Alcaligenes sp.，将其接种至步骤(3)中的锥形瓶中，在温度为25～30℃、转速为100r/min的振荡器中培养20～22天；

(5)将步骤(4)中的菌液转移到容积为15mL的离心管中，在10000r/min条件下离心10min，弃去上清液；

(6)向步骤(5)中的离心管中加入10mL pH值为9.0浓度为0.08M的NaH₂PO₄缓冲液，旋涡振荡5min后再进行超声波振荡15min，在10000r/min条件下离心10min，弃去上清液分离出菌体；

(7)向由步骤(6)的离心管中加入7mL溶液A，然后混匀；溶液A的组成为：50mL0.45M三羟基甲基氨基甲烷-HCl，20mL0.25M EDTA，20mL0.9M KCl，10mL百分比浓度为2.0％的氯化十六烷基三甲胺，pH8.2；然后加入2.2mgN-乙酰胞壁质聚糖水解酶，在0～4℃条件下振荡10min后加入1.5mL浓度为50g/L的乙氧基化烷基硫酸钠溶液，旋涡振荡5min后在55℃条件下水浴振荡1h，在10000r/min条件下离心10min，收集上清液；

(8)向由步骤(7)得到的上清液中加入1mL浓度为5.5M的醋酸钾和0.5mL异丙醇，在0～4℃条件下振荡15min，在10000r/min条件下离心10min，收集上清液；

(9)将由步骤(8)得到的上清液加入到离心纯化柱上，将离心纯化柱放入离心管中，在10000r/min条件下离心10min，倒去离心管中的液体；重复这一过程，直至所有由步骤(8)得到的上清液都经过离心纯化柱纯化；

(10)向经步骤(9)处理后的离心纯化柱中加入0.5mL溶液B，溶液B的组成为：5mL4.5M盐酸胍，10mL3.5M醋酸钾与85mL无水乙醇，pH7.0；在0～4℃条件下振荡15min，在10000r/min条件下离心5min，倒去离心管中的液体；

(11)向经步骤(10)处理后的离心纯化柱中加入0.6mL溶液C，溶液C的组成为：40mL10mM三羟基甲基氨基甲烷-HCl，30mL3.0M NaCl，30mL1.5mM EDTA，pH8.5；在55℃条件下振荡20min，在10000r/min条件下离心5min；将离心管中的液体重新加入到该离心纯化柱中，在55℃水浴中放置10min，在10000r/min条件下离心5min；离心管中液体即为含有能够降解苯并[a]芘基因的降解质粒溶液，在-20℃保存备用。