[发明专利]一种人PAPP-A和Free-β-HCG时间分辨荧光双标的定量检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于医学检测技术领域，具体属于人妊娠相关蛋白A（PAPP-A）和游离人绒毛膜促性腺激素β亚基定量检测领域。

背景技术

妊娠相关血浆蛋白一A(PAPP—A)是一种大分子糖蛋白化合物，是由胎盘合体滋养层细胞、蜕膜细胞合成并分泌进入血循环，且随孕周逐渐增多的母体血浆高分子糖蛋白。妊娠相关血浆蛋白PAPP-A分量为8000kD，为四个相同的亚单位组成的四聚体。是由两个PAPP—A分子和两分子嗜伊红主要碱性蛋白前体(hDMBP)组成的异构聚合体，其生物学功能尚不完全清楚。近年来，运用PAPP—A在孕早期染色体异常核型的筛查，高危妊娠的监护及妊娠滋养细胞疾病的诊断等方面取得了进展。

hCG是胎盘滋养层分泌的糖蛋白,β-hCG升高是多种胎儿染色体异常的特征,常伴有胎儿自然流产。1987年Bogart最先报道了孕中期β-hCG变化与Dow n’s综合征的发生有关。Hsu发现β-hCG≥2.5M时,Dow n’s综合征检出率为40%。王晓雯等发现在孕中期，胎儿为Dow n’s综合征的孕妇血清、血浆和全血等样本中β-hCG水平高出正常值两倍以上。

出生缺陷是我国围产儿死亡的主要原因之一，如在妊娠早、中期筛查出异常胎儿并及时终止妊娠，能有效降低由出生缺陷所引起的围产儿死亡。

目前，常用的血清、血浆和全血等样本学免疫检测方法主要有以下3种：

1、放射免疫检测：该方法灵敏度高、特异性强，在医学及其他生物学科的研究领域中应用广泛。近年来，有学者研究了针对自身抗原的液相放射免疫，结果表明检测特异性有所提高。但由于本方法假阳性率较高且存在对人体的放射性损伤等因素现已较少应用。

2、化学发光免疫检测：是一种将发光分析和免疫反应结合起来的测定技术。主要有化学发光酶免疫技术、化学发光标记免疫技术和电化学发光免疫技术。化学发光免疫测定法有较高的敏感性与特异性，且本底低，是一个较为活跃的研究领域。近期有研究表明，应用化学发光法检测应将被测血清做100倍稀释才能避免钩状效应的产生，得到更准确的结果。该法具有高敏感性和高特异性。测定范围宽、试剂稳定、无毒害、无污染、操作简单、耗时短等优点但因其价格昂贵，在国内应用较少。

3、酶联免疫检测：是一种敏感的技术，可以在微克乃至纳克水平对所测物质进行定量检测，具有快速、敏感、简便、易于标准化、投入低、基层实验室也可开展等优点。但也存在固有缺陷，主要表现为：其一，传统包被模式，抗体分子有效利用率降低，不仅浪费抗体增加试验成本，且无效抗体分子占用固相表面的有限面积，导致抗体包被量不足影响检测的敏感度和检测范围；其二，抗体分子包被量受固相表面积限制，包被抗体量相对不足，导致不能形成双抗体夹心复合物，抗原分子只与酶结合抗体反应，此时虽然待测抗原含量很高，没产生较高的检测信号。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种人妊娠相关蛋白A（PAPP-A）和游离人绒毛膜促性腺激素β亚基（Free-β-HCG）荧光定量检测试纸条及其制备方法。采用荧光定量配体受体分析方法和免疫层析分析方法制备成本发明的荧光定量检测试纸条，它可对人血清、血浆和全血等样本中人妊娠相关蛋白A（PAPP-A）和游离人绒毛膜促性腺激素β亚基（Free-β-HCG）进行快速定量检测，整个检测时间仅需10min，完全满足孕早期血清、血浆和全血等样本中人妊娠相关蛋白A（PAPP-A）和游离人绒毛膜促性腺激素β亚基（Free-β-HCG）的大规模筛查检测。

一种人PAPP-A和Free-β-HCG时间分辨荧光双标的定量检测试剂盒，其包括荧光定量检测试纸条和示踪探针；

所述的荧光定量检测试纸条，采用以下方法组装而成：在PVC薄板上依次搭接并粘贴滤纸、玻璃纤维素膜、划有两条检测线和一条质控线的硝酸纤维素膜、吸水纸，组装完毕后剪切成试纸条，即得本发明的时间分辨荧光双标定量检测试纸条。

该试纸条的示踪物采用时间分辨荧光纳米微球进行标记，并用西林瓶冻干之后单独保存。

所述检测线T1、检测线T2及质控线C相隔均为0.5cm距离。

所述荧光纳米微球标记示踪物为相关蛋白A（PAPP-A）二抗、Free-β-HCG二抗及羊抗兔二抗；

优选的，所述纳米微球粒径范围为100-300nm；

所述荧光纳米微球的荧光发光物为铕、钐、铽、镝等稀有元素；优选的，粒径范围为150-250nm。

所述荧光纳米微球表面电荷为50-250μeq/g；

所述荧光纳米微球羧基密度为为25-35.7sq.A/grp。