[发明专利]一种五倍子蚜介导的可诱发基因转移的含微生物混合物在审
申请号: | 201310161440.0 | 申请日: | 2013-05-06 |
公开(公告)号: | CN103320348A | 公开(公告)日: | 2013-09-25 |
发明(设计)人: | 任竹梅;王莉 | 申请(专利权)人: | 上海立倍特种生物科技有限公司 |
主分类号: | C12N1/20 | 分类号: | C12N1/20;C12Q1/68;C12R1/01 |
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地址: | 201203 上海市*** | 国省代码: | 上海;31 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 五倍子 蚜介导 诱发 基因 转移 微生物 混合物 | ||
1.一种由五倍子蚜介导的可诱发转基因工程的含蚜虫共生菌Buchnera混合物,其特征是五倍子蚜寄生在第一寄主植物上形成虫瘿,虫瘿中充满五倍子蚜和其分泌物,分离这些物质,经研磨、过滤分离、镜鉴、渗透培养、拟南芥培养打顶处理、浸渍转染、基因组DNA提取、PCR扩增、序列测定、数据分析等检测到发生了基因转移的序列。
2.如权利要求1所述的一种可以用于鉴定五倍子蚜分泌成分发生基因转移微生物菌诱导的操作方法,具体操作如下:
1)在五倍子蚜成熟期采集五倍子标本,挑选较大的、没有开裂、完好的倍子,剖开,分离其中的白色排泄物,称重。
2)样品无菌状态下研磨,尽可能细。加30mL无菌水,调成糊状,进行如下处理:
a.取10mL研磨液于灭菌培养皿,制成1号浸渍液;
b.剩余的加20mL无菌水,分装,称重配平,1000r/m离心,去渣。
c.上清液经100μm过滤器过滤,取10mL于新的灭菌培养皿,制成2号浸渍液。
d.剩余的过10μm过滤器,取10mL于新的灭菌培养皿,制成3号浸渍液。
3)每个培养皿加10mL预先配好的10%的蔗糖溶液和5μL Silwet L-77辅助剂,室温静置1h。
在以上样品处理前,提前培养拟南芥植物生长到开花可以打顶状态。
4)拟南芥打顶,去掉开花的部分,每一Pot的拟南芥分别进行浸花和毛笔蘸液涂花处理。一般主枝的花在培养液里浸渍,时间为2min;刚生的幼枝或短的含有花蕾的枝采用毛笔涂布方法。
5)处理后拟南芥先暗培养2天,然后恒温恒湿培养,成熟后按不同的处理收集种子。
6)收集的拟南芥种子分别进行种植培养,培养一个半月后采集新鲜的拟南芥叶片材料。
7)采用Tigen植物基因组提取试剂盒提取拟南芥基因组DNA,用昆虫通用引物(在五倍子蚜与寄主植物基因转移研究中得到验证的基因)进行PCR扩增及序列测定和分析。
8)采用DNA序列分析软件,通过与已经测定的五倍子蚜相应的序列进行比较分析,确定筛选得到的序列为发生了转移的基因的部分序列。
五倍子中的分泌物混合物可能是一种基因转移的诱导介质,其中含有的微生物(分子数据分析鉴定为倍蚜的共生菌)在基因转移中起了媒介的作用。
新的可诱导转基因发生的微生物混合物的发现是生物工程技术的一大成果,具有较高的开发和应用价值。
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