[发明专利]基于16S rDNA的细菌核酸指纹特征谱的制备方法及其用途

权利要求书

1.一种基于细菌16S DNA的核酸指纹图谱制备方法。其特征在于，它至少包括如下步骤：

（1）PCR反应：使用针对细菌16S rDNA的PCR通用引物，分别扩增多个细菌的核酸模板，得到含扩增目标区域的PCR产物；

（2）SAP酶消化：用碱性磷酸酶（SAP酶）处理步骤（1）得到的PCR产物；

（3）转录和核酸酶切：使用特定的转录和内切酶，分别在一个反应体系中，对步骤（2）得到的各个细菌的消化产物进行转录和核酸酶切，获得一系列长度不一、丰度不一的核酸片段；

（4）纯化：使用树脂处理步骤（3）得到的酶切产物；

（5）质谱仪检测：将步骤（4）得到的纯化产物上点在含有基质的靶片上，上质谱仪进行检测，得到不同细菌的特征核酸指纹谱图。

2.根据权利要求1的方法，其中细菌16S rDNA区域选自SEQ ID NO:3所示的区域，或者与SEQ ID NO:3所示序列具有至少60%同源性的序列。在其中的优选实施方案中，优选该序列具有62%、65%、68%、70%、72%、75%、78%、80%、82%、85%、88%、89%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源性的序列；通用引物包括但不限于SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示序列；且用于核酸酶切的特定酶，包括但不限于RNaseA酶。

3.权利要求1或2的方法，其中步骤5的纯化包括在转录和酶切产物中加入超纯水，混匀后，再加入树脂，上下颠倒混匀15分钟；所述质谱仪是MALDI TOF MS质谱仪。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述细菌包括如表1所列的836种细菌。

5.在上述任一方案中，其中所述细菌还包括布鲁氏菌(Brucella)、结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis），以及幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）。

6.利用权利要求1的方法用于建立细菌核酸指纹特征图谱库的方法，至少包括：上述步骤1-5，和；

(6)将步骤5得到的各种细菌16S rDNA的核酸指纹特征图谱，通过计算机软件进行汇总和整理，得到所述的细菌核酸指纹特征图谱库。

7.权利要求7的方法，其中所述软件是BioExplore软件，其版权号为软著登字第136879号、登记号2009SR10700。

8.利用权利要求5或6的方法所建立的细菌核酸指纹特征图谱，用于细菌鉴定或分类的方法，包括：

（1）PCR反应：使用针对细菌的PCR通用引物，扩增待测细菌的核酸模板，得到含扩增目标区域的PCR产物；

（2）SAP酶消化：用碱性磷酸酶（SAP酶）处理步骤（1）得到的PCR产物；

（3）转录和核酸酶切：使用特定的转录和内切酶，在一个反应体系中，对步骤（2）得到的细菌的消化产物进行转录和核酸酶切，获得一系列长度不一、丰度不一的核酸片段；

（4）纯化：使用树脂处理步骤（3）得到的酶切产物；

（5）质谱仪检测：将步骤（4）得到的纯化产物上点在含有基质的靶片上，上质谱仪进行检测，得到该细菌的核酸指纹特征图谱；

（6）将所得核酸指纹特征图谱与细菌核酸指纹特征图谱库进行比较，从而判断待测细菌的类别或种属。

9.权利要求7的方法，其中步骤6通过BioExplore软件进行比较检测。

10.提供能用于细菌分类和鉴定、耐药筛选用途的试剂盒，包括：

（1）用于扩增细菌16S rDNA的通用引物对及其缓冲液；

（2）SAP酶及其缓冲液；

（3）RNAase及其缓冲液；

（4）用于纯化酶切产物的树脂；

（5）用于比对核酸指纹特征图谱的分析软件。

11.权利要求9的试剂盒，其中所述引物是SEQ ID NO:1-2，所述软件是BioExplore软件，所述细菌16S rDNA区域选自SEQ ID NO:3所示的区域。