[发明专利]人源性高分化肝癌细胞株HL1017及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及人源性高分化肝癌细胞株HL1017，本发明还涉及该细胞株的构建方法。 

背景技术

肝衰竭（hepatic failure）是一种严重的临床综合症，常规内科治疗效果不佳，病死率高达70%左右。肝移植是治疗进展期肝衰竭唯一有效的治疗手段，但是目前肝源严重不足，能够接受肝移植的患者比例不足1%。生物人工肝（bioartificial liver，BAL）的出现为肝衰竭的治疗提供了一丝希望，它可以暂时辅助并部分替代病变肝脏的功能，帮助肝衰竭患者自身肝脏功能恢复或使其等到肝移植。 

但是，生物人工肝支持系统缺乏理想的肝细胞源和高效的生物反应器，严重制约着这一新兴治疗技术的发展。目前，进入临床试验阶段的生物人工肝的细胞材料主要包括是猪肝细胞和肝癌细胞株C3A，但是前者为异种细胞，进入人体易导致排斥反应及引起动物源性传染病，后者为肝脏高度恶性肿瘤，具有潜在的致瘤性危险。以上生物材料均存在种种不足，国内外尚无获得官方批准认可的生物人工肝细胞产品，没有任何一种细胞能够完全符合人工肝理想生物材料的要求，生物人工肝的发展也渐入低谷。因此，探寻合适的细胞源，使其在人工肝中充分发挥合成、代谢、解毒等肝脏功能成为生物人工肝继续发展的重要前提和难点所在。 

近年来，各国学者也从不同方面入手，探索新的细胞材料来源。如利用病毒载体将SV40LT或hTERT基因导入肝细胞而构建得到永生化肝细胞株；构建新型的肿瘤来源的肝细胞株；模仿肝细胞生长的微环境，从而提高肝细胞的功能活性。但是，这些技术和产品都存在一些不足和缺陷，而且部分产品国外公司对其享有专利保护。因此，生物人工肝新型细胞材料的研究一直是国家重点支持的方向。 

发明内容

本发明的目的是提供一种人源性高分化肝癌细胞株HL1017，该细胞株具有肝脏的合成、代谢和解毒功能，符合人工肝理想生物材料的要求。 

本发明进一步目的在于提供人源性高分化肝癌细胞株HL1017的构建方法。 

本发明的第一个目的提供的人源性高分化肝癌细胞株HL1017，其保藏号为CCTCC NO：C 201357，该细胞株HL1017具有肝脏最重要的合成、代谢、解毒功能，其各肝功能相关指标从基因、蛋白等不同水平均具有有一定水平的表达，符合人工肝理想生物材料的要求。 

本发明的人源性高分化肝癌细胞株HL1017来源于人的原代肝癌组织，它具有典型的肝癌细胞生物学特性，能在体外连续长期传代，在体外制备已传代100以上，细胞生长状况良好，增殖活跃，具有以下生物学特性： 

1. 形态学特性

在光学显微镜下观察，细胞形态为不规则多角形，接近于正常肝细胞，但体积小于原代肝细胞，细胞核较大，细胞浆丰富。

2. 细胞生长特性 

所述细胞株贴壁后72小时进入对数生长期，细胞倍增时间大约为27小时。

3. 遗传学特性 

该细胞株为多倍体，部分染色体发生突变及异位，具有肝癌细胞染色体的特征。

4.功能特性 

该细胞株具有合成白蛋白、尿素氮、细胞色素P450的功能及合成、储存糖原的功能。利用水凝胶三维培养可不同程度提高该细胞株各肝脏功能指标在基因水平的表达。

5.安全性 

该细胞株的培养上清中乙肝表面抗原(HBs-Ag)、乙肝病毒DNA(HBV-DNA)及丙肝病毒DNA(HCV-DNA)的含量均在安全值范围内。

本发明第二个目的通过以下技术方案来实现：一种人源性高分化肝癌细胞株HL1017的构建方法，包括以下步骤： 

(1) 对已去除结缔组织的离体成人肝癌组织用针头注射器吸取HBSS平衡盐溶液进行多点穿刺灌流，直至整块肝癌组织由暗红色变为灰白色，且流出的HBSS平衡盐溶液变清亮；

(2) 另取针头注射器用37℃预热的Ⅳ型胶原酶在肝癌组织表面再次进行多点穿刺灌流，直至肝癌组织变柔软无弹性；

(3) 分离肝癌组织，去除残存的包膜和纤维结缔组织，放入无菌瓶中，加入 型胶原酶溶液在37℃温度下震荡消化，获得消化液；

(4) 在消化液中加入培养基中和胶原酶，并处理成细胞悬液，过滤，收集细胞，细胞接种培养，获得存活细胞；

(5) 对步骤(4)中得到的存活细胞连续培养并传代50代以上，至其细胞形态及功能水平不再发生明显变化，则获得细胞株HL1017。

作为本发明的一个实施方式，具体的制备方法如下：