[发明专利]一种酶法制备新橙皮苷的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶法制备新橙皮苷的方法。

背景技术

新橙皮苷属于二氢黄酮类化合物，通常在酸橙、枳壳、枳实、未成熟的柚子中分布，以枳壳中含量较高。药理研究表明，新橙皮苷具有抗菌消炎、抗过敏、抗肿瘤及其抑制黑色素沉积等作用，因此在医药、功能性食品及其化妆品上有着广泛的应用。新橙皮苷还是合成新型甜味剂新橙皮苷二氢查尔酮的重要原料。新橙皮苷二氢查尔酮是一种重要的甜味剂，具有强烈的甜味，它的甜度是蔗糖的1800 倍，口感清爽，余味持久。新橙皮苷二氢查尔酮在欧盟、美国都已经被批准作为饲料添加剂、食品添加剂及其化妆品原料；1997年被我国卫生部列入食品添加剂使用卫生标准增补品种, 可用于食品工业。同时其具有极佳的屏蔽苦味的功效，是一种很好的药物矫味剂。

新橙皮苷的制备方法主要包括: 植物萃取法、柚皮苷化学合成法、橙皮苷酶催化法。橙皮苷酶催化法使用的起始原料橙皮苷来源丰富，便宜易得，且酶催化法反应条件温和，合成中也不需要使用大量的有毒有机原料，从而避免产品中因含有少量的有毒残留物而危害人类健康。因此橙皮苷生物转化法被认为是提供作为医药、功能性食品及其化妆品活性成分的新橙皮苷的一种理想的合成方法。Frydman A.等提供了一种橙皮苷生物转化合成新橙皮苷的方法，包括橙皮苷的化学水解和水解产物通过生物转化生成新橙皮苷两个关键步骤（J. Agric. Food Chem., 2005, 53 ( 25 ) :9708- 9712）。作者考虑到橙皮苷的水溶性极差，橙皮苷的水解采用二甲亚砜做溶剂，稀硫酸做催化剂，在高温密闭体系下进行，水解产物为混合物，包括橙皮苷-7-葡萄糖苷、橙皮素、鼠李糖、葡萄糖和芸香糖等。橙皮素在7- O-葡萄糖基转移酶和鼠李糖基转移酶二步反应的作用下, 生成新橙皮苷; 而橙皮素-7-O-葡萄糖苷仅在鼠李糖基转移酶的作用下直接生成新橙皮苷。该法的缺陷是第一步反应中，化学法高温水解的产物复杂，导致使用的酶体系复杂，而且由于水解过程使用了二甲亚砜，会大大降低酶活，高温水解还会使水解下来的糖被破坏，从而需要补加外源性的葡萄糖和鼠李糖。这些不利因素，使得该方法操作复杂，成本高昂，没有工业化价值。朱思名等在专利中描述了以橙皮苷酶来水解橙皮苷，而后水解物在鼠李糖苷转移酶作用下生成新橙皮苷（申请号：200910193529.9）。作者利用橙皮苷与金属离子形成配合物，大大加大了其水溶性，使得橙皮苷的酶法水解达到能满足工业化生产的水平。该方法的缺陷是，水解产物复杂，主要包括橙皮素-7-葡萄糖苷、橙皮素的混合物，而该混合物在鼠李糖苷转移酶作用下能够转化为新橙皮苷的只有水解体系中的橙皮素-7-葡萄糖苷，转化率太低，产物分离纯化难度增加，导致成本较高。同时鼠李糖苷酶和鼠李糖转移酶成本高，也大大限制了其在工业生产中的应用。因此，寻找一种更高效的以橙皮苷为原料酶法合成新橙皮苷的方法是市场迫切需要的。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种操作简单、环境友好、经济可行的以橙皮苷为原料酶法合成新橙皮苷的方法。

本发明将鼠李糖苷酶和鼠李糖转移酶用固定化酶载体Sepabeads EC-EP或者Sepabeads EC-HA进行固定，经固定化后表观酶活只有液体酶的四分之一到三分之一，但令人惊奇的是，其可以重复使用多达近200次，从而大大降低了酶的成本，远超本领域技术人员的预期。在橙皮苷水解时，通过使用固定化鼠李糖苷酶代替橙皮苷酶，使得反应产物只有L-鼠李糖和橙皮素-7-葡萄糖苷，而没有橙皮素。然后第一步反应产物L-鼠李糖和橙皮素-7-葡萄糖苷，在固定化鼠李糖苷转移酶的作用下，制备得到新橙皮苷。

本发明提供如下技术方案：

提供一种新橙皮苷的双酶法制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

橙皮苷在金属离子作用下溶于水，在固定化鼠李糖苷酶作用下水解，得到橙皮素-7-葡萄糖苷和鼠李糖的混合物。该混合物在固定化鼠李糖苷转移酶的催化下，得到新橙皮苷。

前述的固定化鼠李糖苷酶和固定化鼠李糖转移酶过程是，通过液酶固体纯酶；是在一定离子强度的磷酸钾缓冲体系中进行固定化，得到固定化酶。

所述的橙皮素-7-葡萄糖苷和鼠李糖的混合物经过常见的方法纯化，包括但不限于重结晶，或使用大孔树脂，可以分别得到橙皮素-7-葡萄糖苷和鼠李糖的纯品。

4、本发明还可以分批补料的方式可以实现多次使用。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：