[发明专利]一种改变真菌孢子产量及形态的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及改变真菌孢子产量及形态的方法，通过分子生物学手段对几丁质合成酶基因进行抑制，从而在不同程度上改变几丁质合成酶活性，进而引起真菌细胞壁中几丁质含量发生变化，最终可以改变真菌孢子产量及形态。

背景技术

    真菌孢子通常比其细胞或菌丝体更为稳定，因而能够在恶劣的环境下生存，目前已广泛应用于生物防治及其他商业真菌产品的制备中。真菌细胞壁是真菌细胞外的重要结构，主要由葡聚糖、甘露聚糖和几丁质等组成，为真菌抵御渗透压和机械力等提供保护。几丁质作为细胞壁的重要成分之一在含量上随菌种的不同而有较大差别，在酿酒酵母中占细胞壁干重的1-2%，在构巢曲霉中可达20％。同一菌种的细胞壁几丁质含量也会随着其基因变化和生理状态的不同而改变。几丁质合成是一个复杂的过程，其关键酶为几丁质合成酶(chitin synthase)。几丁质合成酶催化了N-乙酰葡萄糖胺的聚合，使其通过β-(1,4)糖苷键连接构成了几丁质。在不同的真菌中存在着一种至多种类别的几丁质合成酶同功酶。这些同功酶在维持细胞壁完整性和无性孢子产生等方面起重要作用。

发明内容

    本发明的目的在于，利用分子生物学手段对几丁质合成酶基因进行抑制，利用载体上自带的抗性基因进行筛选，从而达到改变突变菌株孢子形态及数量的方法。目前尚未见直接通过抑制几丁质合成酶基因改变真菌孢子形态及产量的方法。

    为了实现上述的任务，本发明采取如下的技术解决方案：

    （1）将目的真菌在菌丝液体培养基中培养，提取目的真菌全基因组；

（2）设计引物从目的真菌全基因组中扩增几丁质合成酶基因片段；

    （3）将几丁质合成酶基因片段与载体连接构建用于抑制形态表达的干扰载体；

    （4）干扰载体转化目的真菌，利用载体上的抗性基因筛选转化子；

    （5）将转化子接入平板，培养一定时间后，统计孢子数量，并用电子显微镜观察孢子形态。

    本发明具有以下有益效果：本发明通过分子生物学手段调控几丁质合成酶基因的表达水平可以大量获得突变株；本发明获得的突变株的孢子产量有明显变化，为原始菌株孢子产生量的3%至150%。本发明获得的突变株孢子形态发生明显改变，如孢子由球状变为椭球状，孢子表面褶皱增加等。

附图说明

图1为黑曲霉原始菌株与突变菌株产量变化图。

图2为电子显微镜下黑曲霉原始菌株与突变菌株形态变化图。 

具体实施方式

    下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

    实施例1

    以黑曲霉（Aspergillus niger）为出发菌株，依次按照下列步骤进行操作：

1、将黑曲霉培养在如下100 ml培养基中：玉米芯粉5%，麸皮4%，硫酸铵0.5%，酵母粉0.5%，葡萄糖0.8%，碳酸钙2%，发酵温度 33℃，发酵周期 4天。

2、收集培养液，抽滤后用滤纸吸干，加液氮研磨成粉，用试剂盒提取基因组DNA后保存于-20 ℃。 以几丁质合成酶基因（chitin synthase B）为目的基因，设计引物如下：

       Primer-F 5' CCATGCCATGGTGGGTAAGGGTTGGAGAA3'

       Primer-R 5' CCATGCCATGGTTGAGGCTTTAACGTATGAC 3'

以基因组DNA为模板，用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，目的片段约为342 bp。

3、将RNA载体转化大肠杆菌感受态细胞后涂布于含氨苄抗性的平板上，于33 ℃恒温培养箱中培养（14-20h）。从转化平板中挑取单菌落，液体培养后用质粒提取试剂盒提取质粒后保存于-20 ℃。分别将载体与目的片段用NcoI限制性酶切后，在T4 DNA连接酶作用下连接成干扰载体。获得的干扰载体利用聚乙二醇介导的原生质体转化方法转化黑曲霉，获得突变菌株。