[发明专利]一种小鼠合体滋养细胞微绒毛膜的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种小鼠合体滋养细胞微绒毛膜的制备方法及其应用。

背景技术

合体滋养细胞微绒毛膜是合体滋养细胞凋亡或被激活时形成的带膜囊泡状结构，目前被认为可能与多种妊娠并发症相关。脱落至母体血液循环的合体滋养细胞微绒毛膜可作用于外周血管，导致血管内皮细胞功能障碍，同时通过调节机体炎性因子释放和调控细胞免疫等多种途径影响母体免疫系统。

已经有大量证据提示合体滋养细胞微绒毛膜与子痫前期、子痫等妊娠期高血压疾病之间的关系，但基于医学研究的伦理要求和妊娠过程的特殊性质，目前尚无法通过临床试验研究合体滋养细胞微绒毛膜在人类疾病中的具体作用及其机制。另外，由于没有以合体滋养细胞微绒毛膜为研究靶点的适用动物模型可以利用，也无法开展动物实验和体内研究。

体外制备和富集有活性的合体滋养细胞微绒毛膜是研究其在子痫前期、子痫等妊娠期高血压疾病中的作用和机制的先决条件，也是建立相关动物模型的基础。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种小鼠合体滋养细胞微绒毛膜的制备方法。本发明所述制备方法以新鲜小鼠胎盘为原材料，采用机械分离和改良差速离心法将小鼠合体滋养细胞微绒毛膜分离出来并进行富集；所得合体滋养细胞微绒毛膜使用蛋白浓度定量进行浓度检测，并以组织多肽抗原（tissue polypeptide antigen,TPA）进行鉴定和定量标记。

本发明的再一目的是提供由本发明所述小鼠合体滋养细胞微绒毛膜的制备方法制备的合体滋养细胞微绒毛膜在建立妊娠期高血压疾病小鼠模型中的应用。

为实现上述目的，本发明采取如下措施：

本发明所述小鼠合体滋养细胞微绒毛膜的制备方法，包括如下步骤：

（1）将新鲜小鼠胎盘采用冰PBS缓冲液洗净后剪碎成胎盘碎片；

（2）取步骤（1）所得的胎盘碎片放置在0.1～0.2mol/L的NaCl溶液中，2～6℃振荡过夜，其中所述NaCl溶液中添加了1～2%的青-链霉素；取上清，差速离心：1000g，10min，弃沉淀；10000g，10min，弃沉淀；100000g，60min，弃上清，得合体滋养细胞微绒毛膜富集沉淀；

（3）将步骤（2）所得的合体滋养细胞微绒毛膜富集沉淀以2～6℃的PBS缓冲液洗涤，再以2～6℃的PBS缓冲液重悬，其中所述重悬步骤中PBS缓冲液中含3～7%的蔗糖，保存于-20℃备用，即得小鼠合体滋养细胞微绒毛膜。

优选地，在上述小鼠合体滋养细胞微绒毛膜的制备方法中，所述步骤（1）中的小鼠为C57BL/6小鼠，8～12周龄，妊娠16～20天，体重25～30g。

优选地，在上述小鼠合体滋养细胞微绒毛膜的制备方法中，所述步骤（1）中的胎盘碎片大小为1～2mm³。

优选地，在上述小鼠合体滋养细胞微绒毛膜的制备方法中，所述步骤（1）中胎盘碎片质量和NaCl溶液体积之比为1g︰40～60ml。

由本发明所述的小鼠合体滋养细胞微绒毛膜的制备方法制备的小鼠合体滋养细胞微绒毛膜可用于建立妊娠期高血压疾病小鼠模型，具体方法为：将制备的小鼠合体滋养细胞微绒毛膜通过尾静脉注射回输入同种品系的孕鼠体内；本发明通过血压监测、病理检查、血液生化指标检测等方法监测其血压、肾脏、心肌病理改变等相关指标变化，并观察其有无子痫抽搐的出现，证实小鼠模型构建成功。

本发明的有益效果在于：

（1）采用本发明所述制备方法制备小鼠合体滋养细胞微绒毛膜，操作简单，实验条件要求不高；

（2）采用本发明所述制备方法制备的小鼠合体滋养细胞微绒毛膜产量大、浓度高，与人合体滋养细胞微绒毛膜在形态和蛋白标记物方面高度相似；

（3）采用本发明所述制备方法制备的小鼠合体滋养细胞微绒毛膜可直接用于研究子痫前期、子痫等妊娠期高血压疾病的发生、发展机制以及开发对抗药物为目的的医学基础和临床研究，也可以用于进一步制备妊娠期高血压疾病动物模型。

附图说明

图1妊娠第18天雌性C57BL/6小鼠胎盘。

图2剪碎的胎盘碎片置于0.15mol/L NaCl溶液中。

图3合体滋养细胞微绒毛膜蛋白的含量检测。

图4合体滋养细胞微绒毛膜组织多肽抗原含量检测。

图5扫描电子显微镜下的C57BL/6小鼠合体滋养细胞微绒毛膜。

图6回输合体滋养细胞微绒毛膜（STBM）后C57BL/6小鼠血压测定值变化。