[发明专利]用于检测香蕉线条病毒的引物、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种用于检测香蕉线条病毒的引物，其特征在于：

引物序列：

BSV Primer-1:5'-atgagtaattctatcacaag-3'；

BSV Primer-2:5'-ttacttcaaatttctgagaa-3'。

2.一种检测香蕉线条病毒的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有：

其中所述BSV Primer-1的序列为5'-atgagtaattctatcacaag-3'；

所述的BSV Primer-2序列为5'-ttacttcaaatttctgagaa-3'。

3.根据权利要求2所述的一种检测香蕉线条病毒的试剂盒，其特征在于所述的DNA Polymerase Mixture包括PCR扩增用的Taq聚合酶、MgCl₂25mM、dNTPs10mM；所述的Positive Control为香蕉线条病毒的核酸。

4.一种检测香蕉线条病毒的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

A、待测样品DNA提取，得模板DNA溶液；

B、采用引物BSV Primer-1和BSV Primer-2对步骤A中的模板DNA溶液进行PCR扩增，得PCR反应液；其中所述的BSV Primer-1序列为5'-atgagtaattctatcacaag-3'；所述的BSV Primer-2序列为5'-ttacttcaaatttctgagaa-3'；

C、取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析；

D、若存在405bp的DNA条带，则证明所检测用品中带有香蕉线条病毒。

5.根据权利要求4所述的一种检测香蕉线条病毒的检测方法，其特征在于步骤A中所述待测样品DNA提取，具体包括如下步骤：

a1、取待检测样品叶片0.1-0.2g,放置于1.5mL的离心管中，液氮冷冻；

a2、通过振荡器剧烈振荡，用玻璃棒将叶片研碎；

a3、加入0.6mL DNA提取缓冲液匀浆，振荡混匀；

a4、65℃温育30min；再加入0.5mL氯仿，混匀5min;

a5、12000rpm离心5min，上层水相移至一新的离心管中;

a6、加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，室温放置30min;

a7、12000rpm离心10min，弃去上清;

a8、70%乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心2min;再用100%乙纯洗一次;

a9、弃去上清，真空干燥5min;

a10、沉淀溶于30μL TE（pH8.0）之中，-20℃保存备用。

6.根据权利要求4所述的一种检测香蕉线条病毒的检测方法，其特征在于步骤B中所述PCR扩增具体包括以下步骤：

在0.2mL离心管中加入10×PCR扩增缓冲液2.5μL，浓度为25mmol/L的MgCl₂2μL，浓度为10mmol/L的dNTPs1μL，1μM的Primer-150pmol，1μM的Primer-250pmol，样品DNA溶液1μL，加水至25μL，然后加入Taq聚合酶0.5μL；94℃变性3min；然后94℃40s，44℃40s，72℃1min，循环35次；最后72℃延伸10min；4℃保存反应产物。

7.根据权利要求4所述的一种检测香蕉线条病毒的检测方法，其特征在于步骤C中所述琼脂糖凝胶电泳分析具体包括以下步骤：

c1、用1×TAE缓冲液和琼脂糖按1.5%的浓度配好，在微波炉中熔化均匀，冷却至50-60℃；

c2、加入核酸染料或浓度为1μg/mL的溴化乙锭,混合均匀，倒入凝胶平台上，插上样品梳；

c3、待凝胶凝固后，拔出梳子，加入适量的TAE缓冲；

c4、取1μL加样缓冲液与5μL PCR反应液混合均匀，然后分别将其和合适的DNA分子量标准物加入样品孔中；

c5、接通电源进行电泳，电压5V/cm；

c6、当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段时，停止电泳；将整个胶置于凝胶成像系统中观察，并照像记录。

8.根据权利要求4所述的一种检测香蕉线条病毒的检测方法，其特征在于在待测样品DNA提取之前对待测样品进行血清学检测，具体步骤如下：

e1、采取50mg表现可疑症状的植物组织，同时用50mg健康组织和组织提取缓冲液作为阴性对照，加入250μL样品抽提缓冲液研磨制成待测样品液；

e2、用包被缓冲液稀释多克隆兔抗BSV抗体，然后在酶联板的加样孔中加入90μL该稀释抗体，37℃保温4h；

e3、然后用洗涤缓冲液洗涤酶联板3次，每孔加入洗涤缓冲液300μL，每次5min；

e4、取待测样品液90μL加入酶联板的加样孔中，并以健康组织和植物组织抽提缓冲液作为阴性对照，4℃保温过夜；

e5、用洗涤缓冲液洗涤酶联板3次，每孔加入洗涤缓冲液300μL，每次5min；

e6、每孔加入90μL合适稀释的第二抗体，即单克隆BSV抗体，37℃孵育2h；

e7、用洗涤缓冲液洗涤酶联板3次，每孔加入洗涤缓冲液300μL，每次5min；

e8、每孔加入90μL合适稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠抗体，37℃孵育2h；

e9、用洗涤缓冲液洗涤酶联板3次，每孔加入洗涤缓冲液300μL，每次5min；

e10、每孔加入新配制的底物溶液90μL，然后在不同时间分别测定它们的OD₄₀₅nm吸收值。