[发明专利]一种来源于大肠杆菌的离子通道基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于作物遗传育种领域，具体涉及一种来源于大肠杆菌的离子通道基因的序列，利用农杆菌将该基因转化到植物中，使植物耐盐能力得到提高。 

背景技术

盐渍化土壤是广泛分布的不利于植物生长的一种土地，盐分胁迫严重影响着植物的正常生长发育。土壤盐碱化问题引起了世界各地学者的日益关注，成为现代土壤学研究的热点。所谓盐土是指土壤饱和提取液中电导率(EC)高于4 ds／m，并且可交换性钠百分数(ESP)的含量低于15％的土壤，这些土壤的pH一般为中性偏碱，当ESP高于15％、pH大幅上升时的盐土又称为盐碱土。盐碱土在陆地生态系统上分布广泛，全世界盐渍土面积约10亿公顷。在全球的干旱和半干旱地区，约有50％的灌溉土地受到盐碱化的影响，区域内的非灌溉土地同样会发生盐碱化。在我国从滨海到内陆，从低地到高原都分布着不同类型的盐碱土壤，盐渍土面积约3 460万公顷，盐碱化耕地760万公顷，即近1／5耕地发生盐碱化。 

人们就逆境对植物影响的认识和研究，首先是从表观生理指标一般性描述开始，其次研究植物在各种逆境下产生的生理生化、生态变化和生理调节机制，最后发展到分子水平，进一步探讨植物对不同逆境的感应、信号传导、基因表达与调控、蛋白质组装和细胞膜功能获得。为更深入了解植物对不同逆境响应的分子机理和研究人工调控的生物技术等方面展示出良好前景。 

抗盐能力因种而异，抗盐性强的植物原生质膜具有极低的透性，在同种盐渍条件下，吸收盐类明显少于抗盐弱的品种，在一定程度上加强了拒盐的作用。所以可利用生理生化指标鉴定、组织培养、转基因等技术培育新的抗盐作物品种，使其适应盐碱土环境 

本项发明利用PTDS法合成了来源于大肠杆菌的离子通道基因，将该基因转化拟南芥，进而提高了转基因拟南芥的抗盐能力，该基因对于培育植物抗盐的植物品种非常重要，具有重要的理论意义和现实意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于将一种来源于大肠杆菌的离子通道基因ENHX2转入植物体内，并对该转基因植物进行功能验证，以证明它具有提高植物的耐盐性的功能。 

一种来源于大肠杆菌的离子通道基因ENHX2，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。 

所述来源于大肠杆菌的离子通道基因ENHX2长1650bp，编码的氨基酸549个。 

所述来源于大肠杆菌的离子通道基因ENHX2通过农杆菌介导转入拟南芥，应用于植物耐盐性。 

所述来源于大肠杆菌的离子通道基因采用人工方法合成，具体包括以下步骤： 

1）ENHX2的人工合成

依照PTDS(PCR-based two-step DNA synthesis，PTDS)方法进行源自大肠杆菌的离子通道基因进行化学合成，在保持ENHX2基因的氨基酸序列不变的基础上，设计引物合成了ENHX2基因。

2）ENHX2农杆菌双元载体的构建 

ENHX2基因植物双元载体在pcAMBIA-1301载体的基础上构建而成，在pCAMBIA-1301载体的多克隆位点处插入两端附加了烟草的染色质附着SAR序列的外源基因的表达单元，这有利于转基因的稳定遗传;在外源基因的表达单元内，我们在目的基因的两侧导入了BamHI和Sacl酶切位点，便于外源基因的插入，外源基因的表达由双 CAMV355启动子+TMV omega leader sequence控制

3）电击法转化农杆菌

参照MicroPulser^TM Electroporation Apparatus Operating Instructions and Application Guide(BIO-RAD公司) 制备农杆菌GV3101感受态.并且将构建好的农杆菌双元载体经电击法转入到农杆菌中。

4）农杆菌介导转化拟南芥 

利用蘸花法将构建好的农杆菌转入拟南芥体内.首先将拟南芥的花苔浸入渗透液中，轻轻搅动约3～5秒后取出，全部转化完毕后，托盘中加入PNS营养液，以黑色塑料袋套盆封口，保持湿润环境，置于22℃培养室,低光强度下生长24小时，即可正常培养。生长约两个月后，收集种子，4℃冰箱贮存待用。

5）拟南芥转化植株种子的筛选