[发明专利]一种饮用水消毒工艺出水遗传毒性的体外微核检测方法

说明书

技术领域

本发明属于水环境研究领域，涉及饮用水的毒性检测分析，特别涉及一种饮用水消毒工艺出水遗传毒性的体外微核检测方法。

背景技术

环境污染对饮用水水质造成威胁，饮用水消毒工艺有效控制饮用水中致病微生物的介水传染病等，在世界范围内广泛应用。但在消毒的同时，消毒剂不可避免的与水中天然有机物(NOM，natural organic matters)及人为污染物、原水中存在的溴、碘离子等反应生成饮用水消毒副产物(disinfection by-products，DBPs)(Richardson，S.D.；Plewa，M.J.；Wagner，E.D.；Schoeny，R.；DeMarini，D.M.，Occurrence，genotoxicity，and carcinogenicity of regulated and emerging disinfection by-products in drinking water：a review and roadmap for research.Mutation Research/Reviews in Mutation Research[J]2007，636(1-3)：178-242)。饮用水安全问题得到广泛关注，针对水质评价开展的方法研究具有重要意义。

目前已报道的DBPs高达600多种，但饮用水消毒过程中产生复杂化合物还无法通过化学分析一一识别。研究表明饮用水消毒过程中产生的部分副产物具有遗传毒性，而DBPs在饮用水中以混合物的形式存在，暴露途径及相互作用尤为复杂，通过对单一DBPs的毒性试验无法准确反映消毒工艺的潜在危害。生物毒性测试以其测定复杂环境样品总体效应的优势彰显，将快速、高通量的生物遗传毒性测试体系应用于饮用水水质应急与预警技术研究显得尤为重要。

体外微核试验是一种检测染色体或有丝分裂器损伤遗传毒性的重要方法(Michael Fenech.The in vitro micronucleus technique.Mutation Research-Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis[J]2000，455(1-2)：81-95)。自1959年由Evans等将蚕豆根尖细胞暴露于电离辐射，以微核发生率反映染色体异常评价遗传毒性以来，微核试验检测方法、技术及手段也在不断进步，由传统镜检法像自动化测试方向发展。经济合作与发展组织(OECD)测试导则No.487(2010)及中华人民共和国国家标准GB/T28646-2012对体外哺乳动物细胞微核试验测试方法用于化学品检测进行补充，将流式细胞仪检测方法纳入规范。微核试验以其经济、结果可靠等优点，且所诱发的微核率在一定范围内存在剂量-效应关系，适于定量化评价饮用水遗传毒性。

现有评价技术的缺点：传统微核试验镜检方法试验周期长，易受主观因素影响；微核的产生分为染色体断裂剂及非整倍体毒剂作用两种类型，以往流式细胞仪检测较难区分微核诱发原因，且多应用于标准化合物分析，未对微核诱发因素的贡献率作定量化计算。目前采用污染指数定量评价饮用水水质毒性，毒性反应不够直观，毒性等级划分有一定的主观性。在大量环境样品遗传毒性分析方面，现有微核技术较难满足需求。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种饮用水消毒工艺出水遗传毒性的体外微核检测方法，包含以下步骤：

1)制备饮用水消毒工艺出水的提取物的溶液；

2)用步骤1)的提取物溶液暴露处理离体的永生化人胚胎肾细胞；

3)步骤2)处理后的细胞依次进行EMA染色和SYTOX Green染料染色；

4)流式细胞仪分析，根据被SYTOX Green染料染色但不被EMA染色的颗粒的大小和形态特征，判别微核、细胞核和亚二倍体颗粒，并记录数目，得到微核率和亚二倍体贡献率，进而得出饮用水消毒工艺出水遗传毒性。

具体的，所述微核率和亚二倍体贡献率的计算公式如下：

微核率(％)＝微核数目/细胞核数目×100％

亚二倍体贡献率(％)＝亚二倍体颗粒数目/微核数目×100％

上述方法中，步骤1)中，所述提取物的制备方法为：采集饮用水消毒工艺出水的水样，水样用玻璃纤维滤膜过滤，再用HLB柱进行固相萃取，以二氯甲烷为淋洗剂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，即得。

提取物的制备方法中，所述HLB柱是经正己烷、二氯甲烷、甲醇、超纯水活化的HLB柱。

所述提取物溶液中的溶剂为二甲基亚砜(DMSO)。