[发明专利]用于水解ATP的酶制剂ATPase-S及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的方法，具体地，涉及一种用于水解ATP的酶制剂ATPase-S及其制备方法。

背景技术

ATP是各种活细胞内普遍存在的一种高能磷酸化合物，水解时释放出能量，是生物体内最重要的能量来源。在细胞中，它与ADP的相互转化实现贮能和放能，从而保证细胞各项生命活动的能量供应。细胞在代谢过程中需要ATP酶水解ATP，从而为细胞正常代谢提供能量，因此寻找能够对ATP发挥水解作用的蛋白制剂，对研究微生物致病机制、微生物组装机制以及细胞损伤机制具有重要的意义。本发明在研究猪链球菌的过程中发现并成功制备了一种新的能够水解ATP的蛋白制剂。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种用于水解ATP的酶制剂ATPase-S及其制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明涉及一种用于水解ATP的酶制剂ATPase-S，其基因序列如SEQID NO.1所示。

第二方面，本发明还涉及前述用于水解ATP的酶制剂ATPase-S的制备方法，包括如下步骤：克隆ATPase-S基因，利用大肠杆菌表达所述基因，即得酶制剂ATPase-S。

优选地，所述方法包括如下步骤：

步骤一，培养链球菌S.suis2-H，制备链球菌前噬菌体基因组DNA；

步骤二，PCR扩增目的基因ATPase-S；

步骤三，构建重组表达载体，转化大肠杆菌，诱导表达ATPase-S。

优选地，所述制备具体为：

取新鲜培养的猪链球菌SS2-H（200μL）与噬菌体SP1（200μL）混合均匀，加入终浓度为0.1mol/L的CaCl₂，轻轻摇匀后放置于37℃孵育30min，取200μL在THB固体琼脂平板划线，37℃培养12-18h；挑取平板上的单个菌落，采用THB固体培养基，37℃培养箱培养18h，然后用生理盐水洗脱平板获得菌悬液，在悬液中加入20mg/mL蛋白酶K至终浓度50μg/mL，37℃温育30分钟，再加10%SDS至终浓度为0.5%，混匀后将消化混合物于56℃温育1小时，冷却至室温；然后采用等体积酚/氯仿抽提，乙醇沉淀；

用适当体积的核酸溶解缓冲液溶解即为猪链球菌前噬菌体基因组DNA。

优选地，步骤二中，所述PCR扩增采用的特异性引物分别为

P1，如SEQ ID NO.2所示；

P2，如SEQ ID NO.3所示。

优选地，步骤二中，所述PCR扩增具体为：

PCR扩增体系为：1μL10μM/L P1、1μL10μM/L P2、2×HiFi DNA PolymerasePCR SuperMix12.5μL、DNA模板2.5μL、水8μL；

其中：PCR扩增反应条件参数为：95℃预变性5min；95℃变性1min，50℃退火30s，72℃延伸1min30s，共35循环；最后，72℃延伸10min。

优选地，步骤三具体如下：

（A）目的基因片段与pEasy-T1载体连接，得重组克隆质粒pEasy-T1-ATPase-S；

（B）以pEasy-T1-ATPase-S为模板，制备得重组表达质粒pEasy-E1-ATPase-S；

（C）重组表达质粒pEasy-E1-ATPase-S转化大肠杆菌BL21；

（D）诱导，收集菌液，纯化，即得ATPase-S融合蛋白。

优选地，所述重组克隆质粒pEasy-T1-ATPase-S的制备包括如下步骤：

（A）建立5μL克隆反应体系：其主要由2μL PCR回收产物、1μL pEASY-T1SimpleCloning Vector和2μL H₂O构成；

（B）将步骤（A）各组分加入离心管中混匀后，在室温25℃条件下反应5min，将离心管置于冰上；

（C）将连接产物加入50μL Trans1-T1感受态细胞中，冰浴20～30分钟、42℃热激30秒，立即置于冰上2分钟，加800μL平衡至室温的LB，200rpm，37℃孵育1小时；

（D）取8μL，500mM IPTG，40μL，20mg/ml X-gal混合，均匀地涂于氨苄抗性的LB平板上，在37℃放置30min,取200μL接种平板培养基，培养过夜；