[发明专利]恒定PH流加发酵法生产高纯度D-丙氨酸

说明书

所属技术领域

本发明涉及D-丙氨酸的生物法制备，尤其是高纯度D-丙氨酸，属于生物发酵和化学合成交叉的领域。 

背景技术

D-丙氨酸作为L-丙氨酸光学异构体，存在于大的有机组织中，如作为细胞壁肽壁糖或肽抗生素的组成成分，是一种重要的手性有机化合物。 

目前D-丙氨酸主要应用于药物生产和食品添加剂上。 

药用上，D-丙氨酸是制药行业进行手性合成的手性原料，主要用于手性药物、药物中间体的合成。目前主要用于生产新型广谱抗生素、D-丙氨醇、多肽等。D-丙氨酸本身也是生产维生素B₆的原料。D-丙氨酸具有伯胺基，能竞争性地替代仲胺与亚硝酸盐生成VANS lyke反应，分解为氮气和有机酸，从而抑制了致癌物质二甲基亚硝胺DMNA的生成。因此D-丙氨酸作为一种新的癌基因治疗方法在临床上被应用。 

在食品添加剂工业，D-丙氨酸，主要应用于增加化学调味料的调味效果，改善人工甜味剂的味感，改善有机酸的酸味。因为D-丙氨酸本身具有强甜味，味感值是4，是氨基酸中最甜的一种。它可以和L-天冬氨酸合成二肽甜味剂阿力甜(2.2.4.4-tea-methylthietanylamine)。阿力甜甜味品质好，味道纯正，没有异味和不愉快的后味，而且只部分参与机体代谢，其最大的产热量只相当于相当甜度蔗糖的0.02％，符合人们目前对低热食品的追求。在糖尿病人的功能食品上具有重要作用。这些应用为该产品提供了巨大的市场空间。 

现在D-丙氨酸的制取方法主要是微生物发酵法和化学合成法。 

微生物发酵法可以通过短杆乳酪酵母将D-环丝氨酸生成D-丙氨酸制得。但是产物浓度低，生产周期长，设备投资大，有副反应，分离较复杂、污染大。而且由于丙氨酸的外消旋的活泼性，产物D-丙氨酸的光学纯度比较低。 

D-丙氨酸的化学合成方法有两种，一种是利用不对称合成法直接得到D-丙氨酸，另一种是通过化学合成法得到D L-丙氨酸的混旋体，再利用各种光学拆分方法，得到D-丙氨酸。 化学合成法采用多种原料和工艺路线，成本较低，生产规模大，适应于工业化生产。但所得到的产物皆为DL-混型丙氨酸，必须进行光学拆分，才可以得到D-丙氨酸。目前用于分离DL-丙氨酸的方法因步骤多，成本高，工业化比较困难。而且化学合成反应机制复杂，工艺过程长；需要纯手性试剂或贵金属络合物作催化剂，生产成本极高。 

目前国外工业化生产D-丙氨酸普遍采用“氨基酸酰化酶拆分法”，该法利用的氨基酸价格昂贵，生产成本仍然较高，只能用于小规模工业化生产。 

由于D-丙氨酸的生理作用被不断发现，其应用越来越广泛，需要研究开发一种适合大规模工业化、能显著降低生产成本的技术。依据微生物对手性与非手性底物的专一性识别机理，筛选可降解L-丙氨酸的菌种，从DL-混型丙氨酸中降解L-丙氨酸，从而得到D-丙氨酸。本发明也是基于此原理。 

目前，自DL-丙氨酸制备D-丙氨酸的研究较少，与我们相类似的专利有3个。一类是利用微生物选择同化法制备(CN02824215.7)，其缺点是伴随L-丙氨酸的同化，L-丙氨酸分解为氨、二氧化碳、草酸、水等，分离液用离子交换树脂进行分离精制，既包括生化过程又包括化学过程，步骤繁多，操作繁琐，不利于工业化大生产。一类是不对称化学转换法制备(CN200610096375)，其缺点是反应机制复杂，工艺过程长，且手性试剂成本极高，不具备工业化应用价值。一类是微生物发酵法制备(CN200610040681.X)，其缺点是没有考虑培养过程中PH值的变化，而PH值的控制对发酵结果影响甚大，而且发酵液中D-丙氨酸分离提取步骤繁琐，操作不易。与本发明相比，首先是菌种的不同，本发明的菌种为自筛，且经过了紫外诱变，产率高；其次是本发明对从发酵液中提取分离D-丙氨酸的方法更加简练，工业使用时操控度更好，得率更高。 

发明内容

为了克服工业上制取D-丙氨酸的不足，本发明专利利用化学合成的成本低廉的DL-丙氨酸在恒定Ph下流加发酵生产高纯度D-丙氨酸。 

本发明所采用的技术方案是：一种D、L-丙氨酸微生物工业化拆分方法，具体步骤和特征如下： 

我们在葡萄园的土壤中筛选到了一株微生物，可快速利用DL-丙氨酸中的L-丙氨酸而对D-丙氨酸利用极少。我们在实验室对本菌株进行了UV诱变，使得它对D-丙氨酸的利用基本为零。通过实验室自控发酵罐和工业化大生产实验，采用低浓度流加酸碱液以中和发酵液， 找出了该微生物发酵生产D-丙氨酸的培养基配方和发酵工艺条件，生产出的D-丙氨酸符合AJI的质量标准，具体如下：