[发明专利]一株可裂解多重耐药铜绿假单胞菌的噬菌体及其治疗感染的应用

说明书

技术领域：

本发明专利涉及可以裂解临床多重耐β-内酰胺类(包括碳青霉烯类)、氨基糖苷类和头孢菌素类抗生素铜绿假单胞菌的噬菌体及其在治疗临床耐药株感染的应用。

背景技术：

噬菌体由和Twort在1907年和D，Herelle在1909年发现。凡存在细菌的场所就可能有相应的噬菌体存活。20世纪初，由于抗生素的发现及临床应用为治疗细菌感染提供了有效途径，以至于对噬菌体生物制剂的研究放缓了步伐。但随着多重耐药致病菌威胁的不断加大，人们需要寻找抗生素以外的疗法治疗感染性问题。因此，噬菌体疗法又引起人们广泛关注。

噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分噬菌体能致相应宿主菌的裂解死亡，故称噬菌体。作为一种细菌病毒，噬菌体具有病毒基本特性和严格的宿主特异性。噬菌体的生长方式包括溶源性生长和裂解性生长。溶源性生长是指噬菌体侵染宿主细菌，其遗传物质与宿主菌核酸相整合，且随着宿主菌增殖而增殖，不引起宿主菌裂解死亡；裂解性生长是指噬菌体进入宿主细胞，破坏其遗传物质的稳定性和完整性，并利用宿主细胞的蛋白质合成其外壳，从而组装成新的完整的噬菌体颗粒从宿主细胞中释放出，伴随着宿主菌的崩解。其释放出的噬菌体颗粒又侵染其他细胞，循环往复，实现链式反应，达到杀死细菌而治疗感染的目的。此外，噬菌体疗法因其特异性强(即噬菌体可专一性针对宿主菌起裂解作用，而对正常体细胞和人体常驻菌群无毒性作用)、治疗副作用少、潜伏期短、具有指数增殖能力、裂解量大、细菌不易对噬菌体产生抗性等优势得到人们的广泛关注。国内也有一些关于铜绿假单胞菌噬菌体、金黄色葡萄球菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体等噬菌体的相关研究和报道：李明等《铜绿假单胞菌噬菌体PaP1生物学特性的研究》确定了分离的铜绿假单胞菌噬菌体PaP1的形态大小、核酸类型、嗜菌特性、最佳感染复数和一步生长曲线等基本生物学特性。张克斌等《铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及其基因组学研究》成功分离了3株铜绿假单胞菌噬菌体，并对其中两株(一株为溶源性噬菌体，一株为裂解性噬菌体，二者具有相同的宿主菌)进行了基因组测序。同时，对已完成测序的PaP3展开了基因组学研究和某些基因功能的研究。周莹冰等《铜绿假单胞菌噬菌体PaP3生物学特性的研究》测定了铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的最佳感染复数、一步生长曲线和吸附值及交叉吸附值等基本生物学特性。郑文旭等《铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及其生物学特性的分析》分离出3株铜绿假单胞菌噬菌体(PaP-c01、PaP-c02和PaP-c03)。其中，噬菌体PaP-c01能裂解6株铜绿假单胞菌，表现相对广泛的裂解谱；其生长曲线显示感染宿主菌的潜伏期为30min，且证实了该噬菌体具有较宽的裂解范围，为噬菌体作为生物制剂用于体内外抗感染的治疗打下基础。成伏波等《噬菌体疗法对烧伤合并铜绿假单胞菌感染小鼠的治疗作用》进行了进一步的动物实验，在铜绿假单胞菌感染实验小鼠后，利用分离纯化的铜绿假单胞菌噬菌体行腹腔注射治疗，证实了噬菌体对烧伤感染小鼠有明显的治疗作用。胡北等《耐亚胺培南铜绿假单胞菌噬菌体分离及其生物学特性分析》和《噬菌体治疗实验性小鼠耐亚胺培南铜绿假单胞菌感染的研究》对可裂解耐亚胺培南铜绿假单胞菌的噬菌体进行了研究。前者从污水内分离耐亚胺培南铜绿假单胞菌噬菌体并进行分析，筛选出2株相对广谱噬菌体φA392、φ1093，并对其生物学、形态学进行研究，证实了该分离的噬菌体裂解性较强、裂解谱较宽，潜伏期较短，可供临床抗感染治疗的研究；后者以小鼠为实验对象建立感染模型，应用宽噬噬菌体进行治疗，结果发现该噬菌体可有效杀灭铜绿假单胞菌以提高小鼠生存率。并且发现延迟治疗3 h的小鼠仍有40％的生存率。杨洪江等的发明(专利公开号：CN102199576A----降解铜绿假单胞菌生物被膜噬菌体的分离与筛选方法)提供了铜绿假单胞菌噬菌体的扩增、分离、保存方法，还针对噬菌体进行了降解菌株生物被膜的实验，得到了降解力强的噬菌体C12；孙建华等的发明(专利公开号：CN101962631A----耐药绿脓杆菌宽噬噬菌体的制备方法)改良了绿脓杆菌噬菌体的分离纯化方法；胡俊波等的发明(专利公开号：CN1699559A----一株耐亚胺培南绿脓杆菌噬菌体及其用于治疗耐亚胺培南绿脓杆菌感染的用途)分离出的宽噬绿脓杆菌噬菌体φA392用于耐亚胺培南的绿脓杆菌感染的治疗。张智英等的发明(专利公开号：CN101220349A----一种分离的大肠杆菌噬菌体及其作为生物杀菌剂在食品和抗感染中的应用)分离出一种大肠杆菌噬菌体作为生物杀菌剂应用于抗感染；何俭等的发明(专利公开号为：一株治疗金黄色葡萄球菌感染的噬菌体)分离出的一株金黄色葡萄球菌噬菌体用于治疗金葡菌感染及处理被金葡菌污染的食品、饲料及器皿等。但是当前，宽噬噬菌体的分离筛选仍然较少，尤其裂解多耐药菌的宽噬噬菌体的分离极少，大大限制了临床应用研究。为此，我们从临床患者排泄物及医院环境、居民生活环境中广泛采样，分离铜绿假单胞菌毒性噬菌体，筛选得到可裂解多重耐β-内酰胺类(包括碳青霉烯类)、氨基糖苷类和头孢菌素类抗生素铜绿假单胞菌的宿主谱宽的噬菌体，从而为临床解决铜绿假单胞菌耐药性菌株感染提供新的治疗途径。