[发明专利]一种固相片段法合成艾塞那肽

说明书

技术领域

本发明涉及多肽固相合成领域，特别涉及固相片段法合成艾塞那肽。

背景技术

艾塞那肽是由39个氨基酸组成的多肽，其序列为：His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser。艾塞那肽的氨基酸顺序与人胰高糖素样肽-1(GLP-1)有53%的同源性，与GLP-1受体具有高度亲和力，也具有显著的降血糖作用，与GLP-1具有相同的生理功能。在血糖升高时刺激体内产生胰岛素，在饭后抑制胰高血糖素的分泌，减慢血液摄取营养的速度和减少食物摄入量。艾塞那肽为皮下注射针剂，用于二甲双胍、磺酰脲类或二甲双胍与磺酰脲类联合应用不能充分控制血糖的II型糖尿病患者。

目前艾塞那肽的合成方法有生物合成法与化学合成法两种，生物合成法主要是利用人工基因重组方式得到艾塞那肽全序列（如CN1635117、CN1693459）,该方法存在表达量不高，合成规模不大的缺点。化学合成法主要是利用多肽合成技术，将保护氨基酸逐个偶联成艾塞那肽。现有技术US6924264、US6902744、US7157555中，艾塞那肽的制备均采用传统的固相合成法。该方法由于肽比较长，存在某些氨基酸偶联反应不完全、合成周期长的特点。

因此，本领域迫切需要提供一种新的固相合成艾塞那肽的工艺。

发明内容

本发明旨在提供一种新的固相合成艾塞那肽的工艺。

本发明中提供了一种如式Ⅰ所示的艾塞那肽的固相合成制备方法，将Fmoc-树脂和脱保护剂混合，得到脱保护树脂后，将Fmoc-氨基酸和脱保护树脂缩合，得到Fmoc-氨基酸-树脂；重复上述脱Fmoc保护和将氨基酸同树脂上的多肽缩合的步骤，将氨基酸自C端向N端按顺序依次同树脂上的多肽缩合，形成多肽树脂，所述方法包括步骤：

（1）分别形成如式Ⅱ和式Ⅲ所示的多肽树脂片段；

（2）将式Ⅲ进行切割，得到侧链全保护的如式Ⅳ所示的多肽片段；

（3）将如式Ⅳ所示的侧链全保护的多肽片段偶联至如式Ⅱ所示的多肽树脂片段上，并脱Fmoc，得到如式Ⅴ所示的多肽树脂；

（4）依次偶联剩余的十个Fmoc-氨基酸，并脱Fmoc，得到如式Ⅵ所示的艾塞那肽-Rink Amide树脂；

（5）将如式VI所示的多肽树脂上的多肽和树脂分离，得到如式Ⅰ所示的艾塞那肽；

。

在另一优选例中，形成如式Ⅱ所示的多肽树脂片段时使用Fmoc-Rink Amide AM树脂。

在另一优选例中，形成如式Ⅲ所示的多肽树脂片段时使用CTC树脂。

在另一优选例中，步骤（2）中用于切割树脂上的侧链全保护肽的试剂选自0.1%-10%TFA的DCM溶液或TFE、HOAc及DCM的混合溶液。

在另一优选例中，所述的步骤（3）中将如式Ⅳ所示的侧链全保护的多肽片段偶联至如式Ⅱ所示的多肽树脂片段上的缩合剂选自下述的一种或一种以上的组合：DIC、HATU、TBTU、HBTU、PyBop、HOBt、Cl-HOBt、DIPEA、NMM。

在另一优选例中，脱除Fmoc的方法为用20%哌啶的DMF溶液，且该溶液含有0.5-10%的HOBt，脱除Fmoc2-4次，每次时间为5-30min。

在另一优选例中，步骤（5）中将如式VI所示的多肽树脂上的多肽和树脂分离的试剂选自以下各组：

三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、三异丙基硅烷、水的体积比为90-95：2-5：2-5：1-3，且加入相当于多肽当量的3-20倍的碘化铵和二甲硫醚；

三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、苯甲硫醚、苯甲醚的体积比为90-95：2-5：2-5：1-3，且加入相当于多肽当量的3-20倍的碘化铵和二甲硫醚；或

三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、水、苯酚、苯甲硫醚的体积比为80-85：2-5：2-5：2-5：2-5，且加入相当于多肽当量的3-20倍的碘化铵和二甲硫醚。

据此，本发明提供了一种新的固相合成艾塞那肽的工艺。

附图说明

图1是本发明制备艾塞那肽的合成工艺流程图。

图2是实施例6得到的艾塞那肽粗肽的HPLC图谱；其中各峰情况如下表所示：