[发明专利]一种快速获取鹅OAZ2基因全长CDS序列及快速检测其表达规律的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一个鹅OAZ2相关基因及其编码蛋白的应用，特别涉及一种快速获取鹅OAZ2基因全长CDS序列及快速检测其表达规律的方法。

背景技术

多胺与细胞的生命活动密切相关，在各种癌细胞中多胺的水平均高于正常细胞。因此，维持细胞内多胺水平的稳定就显得尤为重要。鸟氨酸脱羧酶(Omithine Decarboxylase，ODC)是多胺合成代谢中的第一限速酶，在维持细胞体内多胺浓度稳定的过程中发挥重要作用。鸟氨酸脱羧酶抗酶(Omithine Decarboxylase Antizyme，OAZ)是由多胺诱导的能反馈性调节体内多胺水平的蛋白质。OAZ2基因是OAZ家族中关键成员之一，其在调节体内多胺浓度，抑制细胞周期，调节家禽生殖方面具有重要作用。研究证实OAZ2能抑制细胞摄入多胺，但不能促进ODC的降解。而OAZ2存在Ser-186磷酸化修饰，可能在细胞核内发挥重要作用。研究表明，OAZ2虽然不能促进ODC的降解，但能显著性影响细胞G₀/G₁期，而且OAZ2还能参与动物机体的免疫调节。总之，OAZ2是参与调节细胞内多胺代谢的关键酶，而细胞内多胺参与调控细胞的多种生命活动过程。因此，阐明OAZ2基因的结构和功能，建立起OAZ2基因表达规律的快速检测方法具有重要理论意义和实际意义。目前现有技术的分段克隆：将目的基因分成几段来克隆，然后将所有分段的片段进行拼接，最终获得完整的目的片段。在进行分段克隆时需要设计多对引物，且每对引物必须有重叠，在将所有片段克隆出来后还需进行一次PCR反应检测所获取的片段是否为目的片段。快速扩增cDNA末端技术：RACE技术是基于PCR技术基础之上，分别在cDNA序列的3’末端和5’末端设计特定引物，然后进行克隆，从而获得cDNA全长序列的方法。半定量反转录一聚合酶链式反应：首先将mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，取等量的PCR产物在同一块琼脂糖凝胶上电泳检测，然后采用生物信息学分析软件来比较电泳图中目的基因和内参基因条带的光密度值，最后计算目的基因表达量(或拷贝数)的定量检测技术。

但是分段克隆和RACE技术都需要做许多次的PCR和克隆工作，操作过程繁琐，工作量大，耗时长，且成本高。采用半定量反转录一聚合酶链式反应进行定量检测时，其技术原理为PCR反应的终点法，因此只能在PCR反应结束时，获得目的基因片段的拷贝数，不能了解定量过程中的准确变化，期间由于电泳操作的影响，会出现较大误差，不能十分准确的检测目的基因表达量。

发明内容

本发明通过设计全长OAZ2基因的引物，通过RT-PCR扩增直接可以获取全长OAZ2序列，一次PCR和克隆过程就可以获得OAZ2的全长CDS区序列。相较于分段克隆和RACE技术，本方法大大的提高了试验的简便性，节省了试验时间，也很大程度上的降低了试验成本。

半定量法只能通过最终产物的电泳图来判断是否表达，表达量的高低，相当于终点法，这其中还有很多人为影响因素，特别是在进行凝胶电泳的时候加样量是否准确。而本发明采取SYBR Green染料法进行QRT-PCR检测，设计特异性强的荧光定量PCR引物。在PCR反应过程中，可对整个扩增过程进行实时监测，连续地分析与扩增产物相关的荧光信号的变化，采用我们设计的方法(方案)可以直观并准确的测定OAZ2基因在不同组织和不同发育时期的表达规律。

本发明技术方案带来的有益效果：

本发明设计了全长OAZ2基因的引物，应用普通的RT-PCR技术即可获取全长的OAZ2序列，一次性克隆OAZ2的全长CDS序列。相较于以前的分段克隆和RACE技术，该方法能快速的获取OAZ2基因的全长CDS序列，大大的节省了试验时间和试验成本，也避免了分段克隆可能出现的拼接不成功的情况，提高了试验的准确性。另外，本发明设计了OAZ2的短片段荧光定量PCR检测所需的特异性强、PCR反应效率高的引物序列，该引物序列适合应用SYBR-Green染料进行快速检测不同组织和不同发育时期OAZ2基因mRNA表达规律的研究。在实时定量PCR检测过程中，可对整个反应扩增过程进行实时监测，连续地分析与扩增产物相关的荧光信号的变化。因此，该项发明技术为鹅OAZ2基因的结构和功能研究提供了一个快速获取OAZ2基因全长CDS序列的方法，并建立了一套快速、准确、省时省力的研究鹅OAZ2基因mRAN表达规律的方法。

附图说明

附图1OAZ2全长CDS序列的PCR扩增电泳图

附图2OAZ2开放阅读框及其氨基酸序列图