[发明专利]检测HBV的磁性生物探针、试纸条及其制备和使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术与纳米材料技术领域，尤其涉及一种用于乙型肝炎病毒检测的磁性纳米颗粒生物探针、磁性免疫层析试纸条及其制备方法和使用方法。

背景技术

乙型病毒性肝炎，简称乙肝，是一种由乙型肝炎病毒（简称HBV）感染机体后所引起的疾病。乙型肝炎病毒是一种嗜肝病毒，主要存在于肝细胞内并损害肝细胞，引起肝细胞炎症、坏死、纤维化。据世界性卫生组织报道，全球约20亿人曾感染过HBV，其中3.5亿人为慢性感染者，每年约有100万人死于HBV感染所致肝肝衰竭、肝硬化和原发性肝癌（HCC）。我国于2006年进行的乙型肝炎流行病毒调查结果表明，我国1-59岁人群乙肝表面抗原携带率为7.18%，5岁以下儿童的HBsAg携带率仅为0.96%，据此推算，我国现有的慢性HBV感染者约9300万人，其中有症状需要治疗的活动性乙型肝炎患者约为2000多万。

乙型肝炎是我国当前流行最为广泛、危害性最严重的重大传染病，HBV携带者有1.3亿以上，其中10%以上转为慢性肝炎，部分演变为肝硬化，进而引发肝癌。因此，对HBV在体内是否有复制的准确判断及抗病毒治疗后的准确监测就显得特别重要。

乙肝核心抗原（HBcAg）存在于乙肝病毒颗粒中，而不是以游离状态存在于血液中，是乙肝病毒活动的直接指标。但长期以来，临床医生是根据“两对半”五种试剂盒检验结果判断乙肝患者的病情，根据HBV-DNA PCR荧光定量试剂盒对血清乙肝病毒DNA测定了解药物疗效。但“两对半”试剂不能很好的反映乙肝病毒的存在状况，不能定量。

HBV-DNA定量PCR检测是目前HBV诊断的金标准，但是该技术对实验操作人员的技术要求高以及实验成本高、耗时长（一般需要3天以上才能得到检测结果），使其在所有医院的推广使用受到了限制，而HBV核心抗原和前S1抗原都出现在急性HBV感染的最早期，目前被认为是乙肝病毒存在和复制的标志，而且与HBV-DNA复制水平高度正相关，因此HBV核心抗原和前S1抗原的联合检测可以相互补充，对于乙型肝炎诊断、治疗和预后等方面具有重要的临床指导意义。

磁性纳米材料是以具有超顺磁性的铁氧化物（多为四氧化三铁）为内核，以氧化硅为壳层，当该铁氧化物颗粒体积减小到某一数值时，热扰动能将与总的磁晶各向异性能相当，这样，颗粒内的磁矩方向就可能随着时间的推移，整体保持平行地在一个易磁化方向和另一个易磁化方向之间反复变化。从单畴颗粒集合体看，就具有超顺磁性。在单畴颗粒集合体出现超顺磁性的温度范围内，分别在不同的温度下测量其磁化曲线，这些磁化曲线必定是重合在一起的。且不会出现磁滞，即集合体的剩磁和矫顽力都为零。这种超顺磁性也是磁性纳米材料的生物医学应用的基本保障。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于克服了“两对半”试剂不能很好的反映乙肝病毒的存在状况，不能定量检测HBV，而HBV-DNA定量PCR检测实验成本高、耗时长的缺陷，提供一种用于乙型肝炎病毒检测的磁性纳米颗粒生物探针及其制备方法，以及一种用于HBV检测的磁性免疫层析试纸条及其制备方法和使用方法。本发明的磁性纳米颗粒生物探针特异性强，信号灵敏且稳定性好。本发明的磁性免疫层析试纸条既可以实现对乙肝单一标记物的检测，也可以实现对乙肝多种标记物的检测，并且能够通过定量的磁信号实现快速检测HBV。

本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。

本发明提供了一种用于HBV检测的磁性纳米颗粒生物探针的制备方法，其包括下述步骤：（1）对粒径为50-300nm的磁性纳米颗粒进行表面氨基化处理，得表面氨基化的磁性纳米颗粒；对所述表面氨基化的磁性纳米颗粒进行羧基化处理，得表面羧基化的磁性纳米颗粒；（2）在缓冲液中将所述表面羧基化的磁性纳米颗粒、碳化二亚胺（EDC，又称碳二亚胺）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）混合反应，反应后洗涤，得反应物A；（3）在偶联缓冲液中将所述反应物A和HBV标记物的抗体混合反应，得反应物B；（4）将所述反应物B与含氨基的化合物的溶液混合反应，反应后洗涤，即得。

步骤（1）中，所述的磁性纳米颗粒可为纳米材料领域中常规的磁性纳米颗粒。所述的磁性纳米颗粒具有超顺磁性。所述磁性纳米颗粒的比饱和磁化强度较佳地在25-45emu/g。所述的磁性纳米颗粒较佳地为具有核壳结构的磁性粒子/氧化硅复合材料，即：所述的磁性纳米颗粒的内核为磁性粒子，所述的磁性纳米颗粒的壳层为氧化硅。所述的磁性粒子较佳地为铁氧化物，如四氧化三铁。所述磁性粒子/氧化硅复合材料的壳层的厚度较佳地为5-50nm。