[发明专利]一种属内重组真菌免疫调节蛋白的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种属内重组真菌免疫调节蛋白的制备方法，包括如下步骤：

（1）构建表达载体；

（2）转化至大肠杆菌；

（3）扩大培养；

（4）IPTG诱导表达；

（5）分离纯化；

所述属内重组真菌免疫调节蛋白为属内重组真菌免疫调节蛋白基因reFIP-SN15的表达产物，其序列如SEQ ID NO.1所示；

所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21菌株。

2.如权利要求1所述的属内重组真菌免疫调节蛋白的制备方法，其中，所述步骤（1）构建表达载体的具体方法为：

a.根据属内重组真菌免疫调节蛋白基因reFIP-SN15的序列，设计引物，并在上游和下游引物上分别添加限制性内切酶位点Bam H I和HindⅢ，以构建原核表达载体;

b.以reFIP-SN15基因为模板，经PCR扩增后，将reFIP-SN15基因克隆至中间载体;

c.用双酶切将reFIP-SN15片断从中间载体上切下，回收相应片段，用T4连接酶16℃连接过夜得表达载体。

3.如权利要求2所述的属内重组真菌免疫调节蛋白基因的制备方法，其中，所述步骤b中的所述中间体为pMD18-T simple vector或pET-30a。

4.如权利要求1所述的属内重组真菌免疫调节蛋白基因的表达方法，其中，所述步骤（2）的具体方法为：将所述表达载体转化至大肠杆菌宿主细胞,用含有50mg/mL的卡那霉素的LB平板筛选转化子并挑取阳性克隆；

所述转化条件为：表达载体加入大肠杆菌感受态细胞冰上放置30min，之后42℃循环水浴热击90s，迅速冰浴2min。之后加入800μLLB培养液37℃慢摇复苏1h。

5.如权利要求1所述的属内重组真菌免疫调节蛋白的制备方法，其中，所述步骤（3）的具体方法为：将获得的阳性克隆接种于含有50mg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜，次日以2%接种量接种，37℃继续发酵。

6.如权利要求1所述的属内重组真菌免疫调节蛋白的制备方法，其中，所述步骤（4）的具体方法为：当发酵液OD₆₀₀达到0.5～0.7时，加入IPTG进行诱导，IPTG的终浓度为1mM。

7.如权利要求1所述的属内重组真菌免疫调节蛋白的制备方法，其中，所述步骤（5）的具体方法为：

a.将经过IPTG诱导的菌液离心收集细胞，悬浮于缓冲液中；将混合物置于液氮中冷冻，之后再于冰水中融化；

b.将融化后的样品在冰水混合物中超声波破碎；

c.超声处理过的菌液离心取上清，上Ni-NTA柱，用缓冲液1洗柱后，用缓冲液2将目的蛋白洗脱出来；

所述缓冲液1为50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，20mM imidazole，pH为8.0的水溶液；

所述缓冲液2为50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，250mM imidazole，pH8.0的水溶液。

8.如权利要求1所述的属内重组真菌免疫调节蛋白在抗肿瘤药物研发中的应用。

9.如权利要求8所述的属内重组真菌免疫调节蛋白在抗肿瘤药物研发中的应用，其中，所述抗肿瘤药物是指用于抗人肺癌或乳腺癌的药物。

10.如权利要求9所述的属内重组真菌免疫调节蛋白在抗肿瘤药物研发中的应用，其中，所述抗肿瘤药物是指用于抗乳腺癌的药物。