[发明专利]利用柿木屑栽培金顶侧耳的方法

权利要求书

1.一种利用柿木屑栽培金顶侧耳的方法，其特征包括如下步骤：

A、筛选具有柿木屑分解优势的金顶侧耳株：

A-1、金顶侧耳种紫外诱变：

A-2、诱变株的初筛：以78%致死率的时间作为照射剂量诱变金顶侧耳原生质体，待原生质体在柿木屑分解优势菌株再生平皿已再生出菌落后，取优先再生出来、菌落直径最大、生长最旺盛的菌落进入复筛阶段；

初筛培养基：柿木屑粉40g/L、麸皮10g/L、KH₂PO₄1g/L、MgSO₄·7H₂O1g/L、pH值6.0、琼脂20g/L，麸皮煮沸30min，过滤去渣取浸提液，柿木屑粉碎过80目筛得粉状，直接加入培养基，常规灭菌；

A-3、诱变株的复筛：将初筛选出来的菌株每株接10支PDA斜面培养基至菌丝长满斜面，计算菌丝生长速率，从中选出长速快、长势好的菌株进入精筛；

A-4、诱变株的精筛：将复筛出来的菌株每株接入10支栽培料培养基试管上进行培养，栽培料培养基：柿木屑60%、啤酒糟20%、柿树叶10%、麸皮8%、生石灰2%，加入水或水溶液，料水比为1:1.4进行拌料，121℃下高压灭菌150min；取长速快、长势好的菌株;

B、菌种扩繁

B-1、液体培养

取栽培时所用相同的啤酒糟3%，加入去皮马铃薯12%、麸皮1%共煮沸30min，过滤去渣即得培养基浸煮液，再加入KH₂PO₄1g/L、MgSO₄·7H₂O1g/L、pH值6.0、琼脂3g/L，柿木屑添加量为10%，粉碎过80目筛后直接加入培养基中，即得发酵培养液，培养液分装完毕后，瓶口包扎四层棉布，棉布外加盖两层报纸，进行高压灭菌，121℃、0.1-0.15MPa灭菌30min；

将灭过菌的液体培养基中放入接种箱中，表面紫外或甲醛熏蒸灭菌后进行接种，每瓶接精筛保存的PDA斜面菌种1cm²大小菌块四块，静置24h后放入转速为160r/min、温度为25℃恒温摇床培养96h，生物量达到25g/100mL以上，镜检合格后使用；

B-2、麦粒菌种扩种：培养基为麦粒79%、柿木屑20%、生石灰1%。将麦粒用自来水浸泡10h后，煮沸至麦粒掰开无白芯为止，滤去水分，摊开晾干，加入柿木屑、生石灰搅拌均匀，pH值自然，用500mL的细口瓶或双层聚丙烯塑料袋装至瓶/袋肩，0.10-0.15MPa灭菌2.5h；避光培养至满瓶/袋后7-15天即可在金顶侧耳栽培过程中应用；

C、金顶侧耳栽培：取步骤A-4的栽培料培养基，装入17cm×32cm×0.05cm聚乙烯塑料袋，每袋装干料300g，121°C高压灭菌150min，冷却后，按照5-10%的接种量接入；

20℃避光培养至满袋后，敞开袋口进行生殖生长管理阶段，此阶段保持温度15-20℃，空气湿度85-95%。

2.根据权利要求1所述利用柿木屑栽培金顶侧耳的方法，其特征步骤A-1所述金顶侧耳种紫外诱变包括：

1）菌丝体制备：培养基配方为去皮马铃薯20%、麸皮2%、KH₂PO₄1g/L、MgSO₄·7H₂O1g/L、pH值6.0、琼脂0.3%。培养条件为160r/min、温度为25℃恒温摇床培养7天，

2）原生质体制备：

2-1）将已培养好的菌丝置于离心管中6000r/min离心10min，去上清液，用浓度为109g/L甘露醇渗透压稳定剂洗三次，按每300mg湿菌丝加1mL酶解液酶解，酶解温度为30℃，酶解时间为150min；

酶解液是含有6g/L纤维素酶和6g/L蜗牛酶的混合酶的109g/L甘露醇溶液；

2-2）稀释：用浓度为109g/L甘露醇溶液稀释原生质体悬浮液至浓度为10⁵个/mL；

3）紫外诱变：紫外灯15W，照射距离30cm，照射剂量30s。

3.根据权利要求1所述利用柿木屑栽培金顶侧耳的方法，其特征在于步骤A-2、A-4、B-1所述柿木屑是柿木枝条粉碎，过80目筛得到的木屑粉；步骤B-2、C栽培用途下所述柿木屑，是柿木枝条粉碎成木屑样粉片。

4.根据权利要求1所述利用柿木屑栽培金顶侧耳的方法，其特征在于步骤A-4所述加入培养料的水溶液为柿树树叶浸提液，浸提方法是将自然风干的柿树树叶浸泡10h后，加热煮沸30min，料水配比为6g/100mL(w/v)，冷却过滤后装入试管中，121℃下高压灭菌150min备用。