[发明专利]用于病毒增殖的非致瘤性MDCK细胞系

说明书

本申请是国际申请号为PCT/US2005/045587，国际申请日为2005年12月16日的PCT国际申请进入中国国家阶段后申请号为200580048006.5，发明名称为“用于病毒增殖的非致瘤性MDCK细胞系”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及可用于制备疫苗材料的新型非致瘤性MDCK细胞。非致瘤性MDCK细胞能适应无血清培养基。本发明还涉及用于增殖非致瘤性MDCK细胞的培养基制剂和培养方法以及维持本发明此细胞系非致瘤性质的方法。本发明还涉及利用非致瘤性MDCK细胞进行细胞培养制备流感病毒的方法。本发明也涉及通过所述方法获得的病毒(例如，流感病毒)和含有该类病毒和/或其组分的免疫原性组合物。

背景技术

疫苗接种是预防每年流感流行所致疾病的最重要公共卫生手段。疫苗的有效应用取决于能否从稳定而容易地培养细胞而快速制备大量疫苗材料(例如，病毒)。快速开发疫苗及大量获得疫苗材料对抵御许多人和动物疾病至关重要。疫苗生产滞后及其产量不足可能导致不能控制疾病爆发。例如，近年的研究提出其原因关系到生产抗流感疫苗需要的前导时间很长。参见，例如Wood,J.M.,2001,Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.,356:1953。有效的疫苗生产需要在高产宿主系统大量培养产生疫苗材料。为获得可接受的收率，不同疫苗材料需要不同的培养条件。可利用含胚蛋、原代组织培养细胞或在已建立的细胞系生产疫苗材料。然而，目前这些宿主系统有下述诸多局限性。

将含胚鸡蛋用于流感疫苗病毒生产通常是已知时间、劳动力和成本密集型加工方法，该方法需要控制鸡交配和鸡蛋受精。此外，对鸡蛋过敏的人禁用鸡蛋生产的流感疫苗，因为可能发生严重的超敏反应。因此，疫苗行业已努力开发了不利用鸡蛋的替代生产平台，例如在细胞培养系统中生产流感疫苗。

应用原代组织培养细胞受阻于开发和维持稳定的原代细胞群困难。常利用已建立的细胞系来克服原代细胞的技术局限性。然而，已知这些细胞系中许多有致瘤性，从而产生安全顾虑，用它们来生产疫苗显然受到管理制约。事实上，世界卫生组织的应用指南指出只有少数细胞系能用于疫苗生产。在细胞培养基中使用动物或人来源的血清和/或蛋白质添加剂也产生了其它问题。例如，熟知各批次添加剂之间在质量和组成上有差异以及污染支原体、病毒、BSE-因子和其它传染因子的风险。总之，血清或血清来源的物质，例如白蛋白、转铁蛋白或胰岛素可能包含有害物质从而污染培养物及其产生的生物学产品。因此，许多组织正试图开发无需血清或血清来源产品的有效宿主系统和培养条件。

因此，需要建立能以低成本、高安全性和稳定的方式(优选无血清或无动物蛋白的培养条件)生产疫苗材料的非致瘤性细胞系。这类细胞系统对生产流感疫苗材料特别有用。

Madin Darby狗肾(MDCK)细胞通常用于流感病毒滴定(Zambon M.，刊于Textbook of Influenza(《流感教材》)，Nicholson编，Webster and Hay，第22章，第291-313页，Blackwell Science，(1998))。1958年从正常的雄性考克斯班尼犬(cocker spaniel)的肾脏建建立了这些细胞。ATCC列出了为S.Madin和N.B.Darby保藏的MDCK(CCL34)细胞系，然而MDCK细胞的其它许多谱系也可用。Leighton J及其同事出版了一系列证明MDCK细胞致癌特性的论文(Leighton等，1968,Science163:472；Leighton等，1970,Cancer26:1022和Leighton等，1971Europ J.Cancer8:281)。然而，用于这些研究的MDCK细胞谱系和传代次数未见描述，并且早已知道谱系和传代次数不同的MDCK细胞显示在染色体数目和结构上不同，这种不同可导致细胞具有致瘤特性(Gaush等，1966,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,122:931)。