[发明专利]一种抗CD20单克隆抗体-海兔毒素偶联物及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和药物领域，具体涉及一种抗CD20单克隆抗体-海兔毒素偶联物及其制备方法和应用。

背景技术

CD20是B淋巴细胞和B淋巴瘤细胞表面特有的膜表面蛋白，在造血干细胞、原始B细胞、正常血浆细胞以及其它正常组织不表达（Bubien J K等，J Cell Biol，1993，121(5):1121-1132）。因此研制抗CD20抗原的单克隆抗体就可以专一性地杀伤B细胞和B淋巴瘤细胞，达到良好的治疗效果。

Ofatumumab（简称OFA）是全人源化靶向抗CD20单克隆抗体，2009年被FDA批准用于氟达拉滨和阿仑珠单抗治疗无效的顽固性慢性淋巴细胞白血病（CLL）（CASTILLO J．Expert Opin Investing Drμgs，2009，18(4):491-500.）。OFA单抗通过与小型和大型的CD20分子上的小环抗原靶向结合，促使细胞溶解，特异性地诱导CD20阳性细胞凋亡，从而专一性地杀灭B淋巴瘤细胞（BEUM P V，Immuuol，2008，181(1):822-832.），而对其他正常组织无不良影响。

但是同时，由于OFA单抗本身的局限性，使得其杀伤CD20阳性B淋巴瘤细胞的能力非常有限，经过一段时间的治疗没有杀尽的肿瘤细胞又会重新生长并对OFA单抗产生耐药性。因此，OFA单抗杀死肿瘤细胞的能力亟需提高，而通过抗体偶联毒性小分子便能达到此效果。

抗体偶联小分子，即为抗体偶联药物，由单抗与“弹头”药物两部分构成。作为“弹头”的抗肿瘤药物主要通过抑制细胞DNA或蛋白质合成、抑制细胞、有丝分裂等方式来杀伤肿瘤细胞。但这些药物对正常的细胞同样有较大杀伤力，从而极大的限制了该类药物的进一步应用和发展。例如化疗药物海兔毒素（Monomethyl auristatin E，MMAE）是一种人工合成抗肿瘤小分子，它通过抑制细胞内微管蛋白二聚化而诱导细胞凋亡。但由于它具有很强的无选择毒性，会对正常细胞造成伤害，所以其本身并不能成药。

单抗是药物良好的靶向性载体，利用药物分子上特殊的功能基团如：羟基、巯基、氨基等可将药物与单抗相连接而组成化学免疫偶联物，单抗的靶向性能将与之相连的药物“精确”地运送到靶细胞，有效地提高了肿瘤局部的药物浓度，极大地降低体内其他组织、器官的药物浓度，从而达到增效减毒的作用。

申请号为201310046396.9的中国专利文献公开了一种抗CD20抗体-海兔毒素偶联物的制备方法，将OFA单抗重链恒定区第123位的丙氨酸突变为半胱氨酸，以获得OFA单抗与海兔毒素的偶联位点。

由于该制备方法需要对OFA单抗进行定点突变，操作步骤繁琐，并且突变后获得的抗CD20抗体只能偶联1～2个海兔毒素分子，对肿瘤细胞的杀伤力还有待提高。

发明内容

本发明提供了一种抗CD20单克隆抗体-海兔毒素偶联物的制备方法，利用该制备方法获得的抗CD20单克隆抗体-海兔毒素偶联物对CD20阳性细胞具有更高的杀伤力。

一种抗CD20单克隆抗体-海兔毒素偶联物的制备方法，包括：

（1）将抗CD20单克隆抗体溶于缓冲液中，加入三氯乙基磷酸酯，进行还原反应；

所述抗CD20单克隆抗体优选为Ofatumumab单抗。Ofatumumab单抗能够特异结合CD20分子，从而专一地杀伤B淋巴瘤细胞，而对其他正常组织无不良影响。

由于抗CD20单克隆抗体表面的半胱氨酸巯基均用于形成重链-重链、重链-轻链之间的二硫键，因而不存在游离的半胱氨酸巯基用于与海兔毒素偶联；因此在与海兔毒素偶联之前，需使抗CD20单克隆抗体形成链间二硫键的半胱氨酸巯基处于游离状态。

三氯乙基磷酸酯可使抗CD20单克隆抗体链间二硫键断开，优选地，所述缓冲液为pH7.4的PBS缓冲液；三氯乙基磷酸酯与抗CD20单克隆抗体的摩尔比为5.5～10:1；所述还原反应的条件优选为：25～37℃水浴反应1～3h。

（2）将被还原的抗CD20单克隆抗体与带连接臂的海兔毒素混合，进行偶联反应；