[发明专利]miR-29a在小鼠胚胎瘤细胞中的调控作用

说明书

技术领域

本发明涉及miR-29a在小鼠胚胎瘤细胞中的调控作用。

背景技术

微RNA（microRNA，miRNA）在体内的基因调控是当前生命科学的研究热点。miRNA是一类长度在20-22nt的非编码RNA分子，通过形成蛋白-RNA复合物来进行基因沉默的调控功能。目前对于miRNA的生物学功能和调控网络的研究表明，miRNA对于多种疾病都有着重要的作用，因而可能成为诸如肿瘤等严重疾病的治疗手段。miRNA通常在细胞核内经过一系列加工成为成熟体并与Agonaute家族蛋白结合形成RNA诱导沉默复合物（RISC）。RISC通过与靶基因的非编码区上的特定位点结合发挥其生物学功能，根据其结合的互补性高低，抑制靶基因的表达或是引起靶mRNA降解，达到负调控靶基因的表达。

近年以干细胞为研究材料的再生医学领域得到了关注和发展，由于干细胞材料的获取困难，而且由于来源的特殊性使其应用遭到了社会伦理的极大阻碍。iPS细胞诱导技术的发明则提供了一个良好的前景，通过加入干性细胞与非干性细胞之间的差异因子，并模拟干细胞生长条件从而获得了一种干性程度接近干细胞的多功能细胞，获得了研究者们极高的关注，对于其中具体机制的研究将可能成为干细胞运用的突破点。通过对干细胞和非干细胞的对比研究，导致两者之间差异的几个标志性差异在逐渐的得到解析，诸如细胞周期，分化程度等因素，这些研究都将会为再生医学的发展带来有力的支持。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种miR-29a基因在抑制小鼠胚胎瘤细胞系中P19细胞增殖中的应用。

本发明的目的之二在于提供一种miR-29a基因在调控小鼠胚胎瘤细胞系中P19细胞周期中的应用。

本发明的目的之三在于提供一种miR-29a基因在下调小鼠胚胎瘤细胞P19细胞系中Ccnd2蛋白表达水平中的应用。

本发明的目的之四在于提供一种miR-29a基因下调在抑制小鼠胚胎干细胞细胞周期运转，促进其分化中的应用。

本发明第一步首先利用solexa测序技术和qRT-PCR技术检测了不同干性程度的细胞中miR-29a的表达量变化，选用细胞为小鼠干细胞系Cgr8，小鼠胚胎瘤细胞系P19，小鼠神经细胞系N2a，并在P19细胞中过表达miR-29a来检测靶基因和细胞周期的变化。

第二步采用流式细胞仪检测和cck8技术，分别检测过表达miR-29a前后P19细胞的增殖和细胞周期变化。

第三步通过Targetscan软件预测miR-29a的靶基因，并将其mRNA的3′-UTR连接至pGL-3载体。将miR-29a与重组质粒共转入HEK-293T细胞，48 h后检测荧光强度。

miR-29a具有抑制细胞增殖，调控细胞周期运转，并且通过与其靶基因Ccnd2的mRNA上3’UTR互补结合，抑制该靶基因的翻译或直接降解其mRNA。通过双荧光素酶报告基因实验验证了Ccnd2是miR-29a的靶基因，并通过qRT-PCR和western blot实验进一步确认miR-29a对Ccnd2的下调作用，所公开的在P19细胞系中Ccnd2为miR-29a的靶基因是首次报道，该发明可以为诱导多能干细胞的iPSC技术提供一定的研究价值。

附图说明

图1三种细胞系中miR-29a的相对表达含量。通过qRT-PCR技术，以CGR8，P19，N₂A细胞的顺序排列，干性依次递减，而miR-29a的表达量升高，证明miR-29a与引起细胞分化有关。

图2 过表达miR-29a后对于P19细胞增殖的影响。以CCK-8法连续测定P19细胞4天的增值情况，miR-29a的过表达引起细胞增殖速度相比对照组减缓，anti-miR-29a组加快细胞增殖，证明miR-29a抑制细胞增殖的作用。

图3 过表达miR-29a后引起P19细胞的周期产生变化。A. 转染miR-29a后P19细胞周期的分布。B. 转染anti-miR-29a后P19细胞周期分布。C. 柱状图显示两组细胞周期分布。结果显示转染miR-29a的细胞处于G₁期的细胞明显多于anti-miR-29a组细胞，而S期细胞则明显减少，证明细胞周期的运转被阻滞在G₁期，无法通过G1/S周期关卡，从而引起细胞增殖的减缓。