[发明专利]BM-RPL32基因片段作为柑橘大实蝇不同发育时期稳定表达的内参基因的应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地，涉及BM-RPL32基因片段作为柑橘大实蝇不同发育时期稳定表达的内参基因的应用。

背景技术

柑橘大实蝇(Bactrocera(Tetradacus)Minax)属节肢动物门，昆虫纲，双翅目，实蝇科，离腹寡毛实蝇属，俗称柑蛆，是危害柑橘类果树的重要害虫，同时也是国际植物检疫有害生物。原产于日本九州硫球群岛的奄美大岛，上世纪六七十年代在我国开始发生，主要分布于四川、重庆、湖北、贵州、云南、陕西、广西、广东、湖南等省、自治区、直辖市。

柑橘大实蝇属于全变态类昆虫，其完成一个生命周期需要经过卵、幼虫、蛹及成虫四种虫态。柑橘大实蝇一年只发生1代，主要危害芸香科的柑橘类果实，以蛹在土壤内越冬，通常越冬蛹于翌年4月下旬开始羽化出土，羽化盛期为4月底至5月上、中旬，成虫活动期可持续到9月底，雌成虫产卵时期为6月上旬到7月中旬，幼虫于7月中旬开始孵化，9月上旬为孵化盛期，幼虫孵化后成群取食橘瓣，到10月中、下旬被害果大量脱落，老熟幼虫随果实落地或在果实未落地前即爬出，入土化蛹、越冬。

内参基因(Endogenous references gene)即内部参照，简单来说就是指在某个条件下恒定表达的基因，主要作为检测目的基因在特定条件下表达水平变化的参照物。常用的内参基因在生物体各类细胞中均有表达，它们是在维持细胞基本生命活动中时刻表达的基因。然而实验研究发现，一些常用的内参基因并不是在所有的情况下均稳定表达，在特定条件下，内参基因的表达发生了变化。因此在选择使用一个内参基因时，应首先验证其在特定的实验条件下是否能够持续稳定的表达。本发明选取的BM-RPL32(核糖体蛋白L32)内参基因，通过半定量RT-PCR技术检测表明其在卵、幼虫、处于滞育状态下的蛹(1天蛹、90天蛹、160天蛹)、雌成虫和雄成虫等不同虫态下均能稳定表达，为研究柑橘大实蝇功能基因及不同发育阶段表达奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供BM-RPL32基因片段作为柑橘大实蝇不同发育时期稳定表达的内参基因的应用，其中，所述BM-RPL32基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示：

CGATTTCTCCGCAGTATTCACGATTTTGCATTAACAGCACCTCCAATTCTCGGACATTGTGAACCAAGAATTTTTTAAAGCCAGTTGGCAACATATGGCGAGTGCGTTTGTTGGAGCCATAACCAATGTTAGGCATGAGGTACTGGC。

根据本发明的具体实施方式，在检测上述BM-RPL32基因片段是否作为内参基因在不同发育时期稳定表达时，使用：

BM-RPL32F1：5′-CGATTTCTCCGCAGTATTCAC-3′；和

BM-RPL32R1：5′-GCCAGTACCTCATGCCTAACA-3′。

本发明还提供了一种柑橘大实蝇不同发育时期稳定表达的内参基因BM-RPL32，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

根据本发明的具体实施方式，柑橘大实蝇BM-RPL32基因147bp核苷酸片段的克隆方法，包括以下步骤：

(1)从柑橘大实蝇成虫提取总RNA，然后反转录合成cDNA：

(2)设计引物：

(3)以cDNA为模板，利用(2)所设引物，PCR扩增柑橘大实蝇RPL32内参基因的核苷酸序列片段；

(4)纯化步骤(3)所得PCR产物，琼脂凝胶回收目的片段，取纯化产物连接到pEASY-T载体上，然后转化大肠杆菌感受态细胞Transl-T，37℃平板培养过夜，蓝白斑筛选含RPL32片段的阳性克隆子；

(5)将(4)所获得的阳性克隆子进行序列测序，测序所得的序列在NCBI上BLAST分析比较，进而确定所得的核苷酸序列为柑橘大实蝇的RPL32片段序列。

本发明所获得的柑橘大实蝇BM-RPL32的147bp的核苷酸序列可作为今后研究研究柑橘大实蝇的功能基因及在不同发育时期基因表达的内参基因。

附图说明

图1BM-RPL32内参基因在柑橘大实蝇不同时期的表达状况；

图2BM-RPL32在柑橘大实蝇不同时期的相对表达量。

具体实施方式

实施例1：柑橘大实蝇内参基因BM-RPL32在不同发育时期的表达分析

1、不同发育时期的柑橘大实蝇总RNA提取：