[发明专利]加强了frr表达的重组淀粉酶产色链霉菌及构建方法与用途

说明书

技术领域

本发明涉及通过加强frr基因在淀粉酶产色链霉菌的表达提高丰加霉素产量，属于基因工程技术领域。 

背景技术

丰加霉素是一种新型核苷类抗生素，分子式为C₁₂H₁₃N₅O₄，核糖C₁连接类似鸟嘌呤的脱氮杂嘌呤环，核心结构为吡咯嘧啶核苷类似物。作用机理主要是通过抑制微生物的转录而影响菌体的生长，其生物活性研究报道主要集中在临床医学领域。近期有研究发现丰加霉素对多种植物疫病具有良好的防治效果，长期使用不会造成环境污染，而且对植物生长也具有一定的调节作用。因此，丰加霉素在农业植物病害防治领域具有的应用潜力。相对于化学合成法，生物法合成丰加霉素以可再生资源为原料，具有反应条件温和、污染少以及成本低廉等优点，因此，生物合成法是目前丰加霉素工业化生产比较经济有效的方法。 

丰加霉素属于次级代谢产物，合成途径复杂，受到多种因素的限制与调控，导致丰加霉素合成水平较低，难以规模化生产。解决该问题的现有办法一般都是通过传统的诱变育种作为主要手段筛选高产优质的生产菌株，但筛选到高效菌株的不确定因素多、周期长。 

随着分子生物学等技术的发展，如何利用先进技术提高次级代谢产物的产量成为研究的热点。核糖体是蛋白质的合成机器, 也是细胞感知营养水平和对生长速率进行调控的重要位点。在稳定生长期, 与次级代谢产物生物合成相关基因的大量表达取决于此时核糖体的功能，研究表明，与核糖体—mRNA—tRNA 终止复合体解离密切相关的核糖体循环因子水平的上升将会导致链霉菌在生长稳定期出现异常的蛋白合成活性, 最终可能会引发抗生素的超量表达。 

目前在链霉菌中过量表达核糖体循环因子编码基因frr以提高目的产物的产量的报道不多。李丽丽等利用SOE-PCR (Splicing by overlap extension PCR)技术扩增了红霉素抗性基因启动子PermE 和 frr结构基因融合片段，插入链霉菌整合型载体pSET152，再利用接合转移法将frr基因整合到阿维菌素生产菌株中，阿维菌素的产量有所提高，但其中获得基因融合片段的过程操作复杂，易产生移码突变。另外此策略只在少数特定的菌株，及特定目标产物上成功过。对淀粉酶产色链霉菌来说，从表达体系的建立到目标产物的提高涉及到复杂的因素，目前尚无报道。 

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种加强了frr表达的重组淀粉酶产色链霉菌及构建方法与用途。 

淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes) 1628是一株拮抗放线菌，其发酵液对多种植物病原真菌具有较强的抑制作用，经分离提取，确定其主要有效成分为丰加霉素，尚未见淀粉酶产色链霉菌的代谢工程分子改造方面的的研究报道。 

本发明首先从以淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)1628 (菌株的保藏编号为CGMCC NO. 2060)中克隆出编码核糖体循环因子frr基因，并将该基因与链霉菌整合表达型质粒pIB139连接，成功构建了携带frr基因的重组载体pIB139-frr，并利用接合转移法将其整合在淀粉酶产色链霉菌1628染色体上。 

一种加强了frr表达的重组淀粉酶产色链霉菌，它表达了菌体中核糖体循环因子编码基因frr，具有比淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes) 1628更高的丰加霉素合成能力。 

所述的原始菌为淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)1628。 

所述的核糖体循环因子编码基因frr来自于待重组的原始菌淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)。 

所述的核糖体循环因子编码基因frr整合入原始菌淀粉酶产色链霉菌染色体。 

所述的加强了frr表达的重组淀粉酶产色链霉菌的构建方法，过程如下： 

1）构建表达载体pIB139-frr；