[发明专利]用于检测蜂蜜的组合物、试剂盒、检测方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于检测蜂蜜中蜜源植物成分的寡核苷酸引物和探针，包含所述引物和探针的试剂盒，以及使用所述引物和探针或试剂盒检测蜂蜜中蜜源植物成分的方法。本发明还涉及所述引物和探针在检测蜂蜜中蜜源植物成分中的应用。

背景技术

蜂蜜，是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，经充分酿造而成的天然甜味物质。蜜源植物种类繁多，如油菜蜜、槐花蜜、荆条蜜、枣花蜜、龙眼蜜、荔枝蜜等等。不同蜜源蜂蜜价格相差较大，高端价位如龙眼蜜和荔枝蜜，低端价位如油菜蜜等。蜂蜜掺假中一种较为普遍的做法是将低价蜜源蜂蜜掺入高价蜜源蜂蜜。针对这类掺假，传统的检测方法，如感官法、物理性状、化学成分分析等，由于受到生产、加工、贮藏条件影响存在很多不确定性。分子生物学技术通过检测植物物种特异性基因片段来判断蜜源，具有特异性强，灵敏度高，不易受环境条件干扰，结果稳定等优点。

发明内容

本发明的目的在于，简单、快速、特异且灵敏地检测蜂蜜中的荔枝、龙眼、洋槐、油菜蜜源植物成分。通过本发明，不仅能检测蜂蜜中花粉沉淀中提取的DNA，而且能检测蜂蜜上清中提取的DNA，能有效防止蜂蜜中添加花粉或过滤花粉的造假方式。

本发明的发明人根据油菜的隐花色素2b基因，设计了能够特异性检测油菜成分的引物和探针；根据洋槐叶绿体pseudoacacia maturase K基因，设计了特异性检测洋槐成分的引物和探针；根据荔枝成熟酶K基因，设计了能同时特异性检测荔枝和龙眼成分的引物和探针。根据龙眼叶绿体铁超氧化物歧化酶(FSD1b)基因，设计了特异性检测龙眼成分的引物和探针。这些基因靶序列小于100bp，保证能从蜂蜜沉淀及上清中检测目标植物成分。

所述油菜特异性上游引物为Bras-cry-F:GAGGATAACCCCGCACTAGC(SEQ ID No.1)，下游引物为Bras-cry-R:GGTGGGAGCCAAGAGACTTC(SEQ ID No.2)；探针为Bras-cry-P:TTTTCATTTGGTGCCCTGAAGAAGAAGG(SEQ ID No.3)，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。洋槐特异性上游引物为Rob-matK-F:GCTCAACCAGGAACGATC(SEQ ID No.4),下游引物为Rob-matK-R:GCAGCATTTGACTACGTACCA(SEQ ID No.5)；探针为Rob-matK-P:CATAAACCTATTATCCGAACATTCATTTCA(SEQ ID No.6)，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。龙眼和荔枝特异性上游引物为Lit-matK-F:TCATGTGTGGTCTCAACCCG(SEQ ID No.7),下游引物为Lit-matK-R：CGTCGCCGACTGGAAAGATA(SEQ ID No.8)；探针为Lit-matK-P:TTACACAAAGATTCTATCAACTTTCTGGGC(SEQ ID No.9)，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。龙眼特异性上游引物为Longan-FSD-F:CCCAAGCTTCCTGATTGGGT(SEQ ID No.10),下游引物为Longan-FSD-R:AGGTGGTGTTTGTCGCTTCT(SEQ ID No.11)；探针为Longan-FSD-P:CTTCATTGAAAGAAAGGCATAACTAG(SEQ ID No.12)，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。

一方面，本发明提供了用于通过实时荧光PCR方法鉴别蜂蜜中蜜源植物成分的组合物，所述组合物包含选自以下（1）至（4）中的任意一组或多组引物和探针序列：

（1）油菜特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.1和SEQ ID No.2以及探针SEQ ID No.3序列；

（2）洋槐特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.4和SEQ ID No.5以及探针SEQ ID No.6序列；

（3）荔枝和龙眼特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.7和SEQ ID No.8以及探针SEQ ID No.9序列；

（4）龙眼特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.10和SEQ ID No.11以及探针SEQ ID No.12序列。