[发明专利]miR-290家族在小鼠胚胎干细胞中的调控作用

说明书

技术领域

本发明涉及一种miR-290家族在小鼠胚胎干细胞中的调控作用。

背景技术

微RNA( microRNA , miRNA )功能调控是当前生命科学的重要前沿。微RNA (microRNA, miRNA)是一类约22 nt的非编码小分子RNA，广泛存在于较高等的真核生物中，大多具有较高的保守性。miRNA作用于特异的mRNA，多使其降解或抑制其翻译，在转录后水平负调控基因表达，而有些miRNA则可以激活靶基因的转录。成熟的miRNA的5′端第2~7位碱基被称为“种子序列”，是有效调控mRNA的关键，miRNA的结合位点不仅可以是靶基因的3′-UTR，也可以是靶基因的5′-UTR或者CDS区域。在哺乳动物中，约30%的蛋白质编码基因受到miRNA的调控。

miRNA在ESC自我更新、多向分化潜能、以及早期分化中起到的重要作用受到了广泛关注。胚胎干细胞是来自于囊胚期胚胎内细胞团，具有无限的自我更新能力和分化成各种细胞类型的潜能，简称为“干性”。基于其独特的生物学特性，胚胎干细胞不仅能够作为体外研究生物发育机制、体细胞重编程、癌症永生化的模型，而且可以分化成特异细胞以代替受伤细胞或生成再生组织，具有极高的医学研究价值。近年来，在小鼠胚胎干细胞(mouse Embryonic Stem Cell, mESC)中特异且高表达的miR-290家簇成为研究的焦点。miR-290家簇在mESC的细胞周期，甲基化过程以及抗凋亡机制中起到重要的调控作用，并且参与到多功能转录因子调控网络中，成为mESC自我更新和分化潜能维持的重要的调控因子。开展miR-290家簇研究不仅有助于了解mESC早期发育机制，促进其在医疗领域的应用，而且也有助于iPS机制研究和技术应用，以及癌症调控机制等方面的发展。

发明内容

       本发明的目的之一在于提供一种miR-290家族在促进小鼠胚胎干细胞增殖中的应用。

本发明的目的之二在于提供一种miR-290家族在促进小鼠胚胎干细胞G1/S转化中的应用。

本发明的目的之三在于提供一种miR-290家族在调控小鼠胚胎干细胞细胞周期和自我更新能力维持中的应用。

本发明通过qRT-PCR手段，在不同多功能分化潜能的细胞系（CGR8>P19>N₂A）中，检测miR-290家族的表达量变化。发现，miR-290家族在mESCCGR8中的表达量最高，在多能性细胞P19中次之，而在已分化的神经母细胞N₂A中没有表达。该结果说明miR-290家族的表达量与细胞的多功能性成正相关性。

将miR-290家族过表达或下调后，检测CGR8、P19、N₂A细胞增殖和细胞周期的变化。在N₂A细胞中转染miR-290家族的mimics，通过CCK8和流式细胞周期分析手段发现，miR-290家族促进N₂A的细胞增殖，并加快G1/S转化。此外，在另两株miR-290家族高表达的细胞系中转染miR-290家族的inhibitor，通过同样的实验方法发现，miR-290的inhibitor能够抑制细胞增殖并增加G1阻滞。上述结果说明在小鼠胚胎干细胞中miR-290家族能促进细胞增殖和细胞周期，有助于胚胎干细胞自我更新和分化潜能维持。

通过TargetScan预测，Ccnd1的3′-UTR中有miR-290家族种子序列的结合位点。将Ccnd1野生型3′-UTR以及含有种子序列突变的3′-UTR构建到pGL-3报告基因的下游，通过双荧光素酶报告分析，发现带有Ccnd1野生型3′-UTR报告基因受到miR-290家族调控，而突变型不受miR-290家族调节。此外，在N₂A和 P19细胞分别过表达和抑制miR-290家族，western blotting结果证明Ccnd1受到miR-290家族下调。上述结果证实，Ccnd1是miR-290家族的靶基因。