[发明专利]一种萤火虫荧光素酶基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的萤火虫荧光素酶基因，特别涉及该基因在生产萤火虫荧光素酶中的应用。

背景技术

萤光素酶是自然界中能够产生生物发光的酶的统称，其中最有代表性的是一种学名为Phot inus pyralis的萤火虫体内的萤光素酶。在相应化学反应中，荧光的产生是来自于萤光素的氧化，有些情况下反应体系中也包括三磷酸腺苷(ATP)。没有萤光素酶的情况下，萤光素与氧气反应的速率非常慢，而钙离子的存在常常可以进一步加速反应(与肌肉收缩的情况相似)。化学反应如下：

萤光素+ATP+O2→氧萤光素+PPi+AMP+CO2+光。这一反应非常节省能量，几乎所有输入反应的能量都被转化为光。在有过量底物和酶存在的情况下，发射光强度与反应体系中的ATP成正比，因此这种发光特性使得萤火虫荧光素酶能够在各种各样的测定ATP的研究和生产中广泛应用，如肿瘤个体化医疗的药敏试验。

目前应用的萤火虫荧光素酶主要是将野生型萤火虫荧光素酶克隆到重组载体中，转到大肠杆菌中表达并纯化。Jeffrey1985年就构建了含有萤火虫荧光素酶基因的重组载体pkw101，利用Jeffrey构建的体系生产，需要经过45度热诱导30分钟的处理，严重影响了酶活性，其他人的生产方法同样存在分离困难，得率低，酶活低等严重问题。

发明内容

针对目前现有技术存在的缺陷，本发明公开了一种萤火虫荧光素酶基因及其应用，使得产品易于纯化，产量高，活性高，稳定性强等特点，是一种高效的生产萤火虫荧光素酶的方法，适合工业生产，个体化诊断中应用。

为解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案实现：

一种萤火虫荧光素酶基因，是通过将野生型的萤火虫荧光素酶基因的第31位赖氨酸突变为丙氨酸后得到的mutLuc基因。

进一步的，所述野生型的萤火虫荧光素酶基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1，所述丙氨酸的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2。

一种萤火虫荧光素酶基因用于生产萤火虫荧光素酶中的应用。

在所述Pet-mutLuc中，由于萤火虫荧光素酶突变处于高效启动子T7基因及乳糖操纵子Lac的控制之下，在一定浓度的异丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)存在时，本发明的萤火虫荧光素酶基因能被高效诱导转录。

利用所述mutLuc基因装入重组表达载体pet-15b的Xho1I和BamHI得到Pet-mutLuc，并将重组载体转入宿主菌(大肠杆菌BL21DE3)中，经所述异丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后纯化得到荧光素酶。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

与现有荧光素酶生产方法相比，本发明由于突变了野生型萤火虫荧光素酶基因以及优化了Luc的密码子，使得该突变的萤火虫荧光素酶具有易于纯化，得率高(每升发酵菌获得酶蛋白大于5mg)，酶纯度高(酶比活力≥1×1011RUL/mg蛋白)，活性高以及稳定性强等特点，是一种高效生产萤火虫荧光素酶的方法，适合工业生产，个体化诊断中应用。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为本发明的重组表达载体Pet-mutLuc结构示意图；

图2为转有Pet-mutLuc的菌株在IPTG诱导条件下的菌体生长曲线图；

图3为IPTG诱导不同时间酶活力测定曲线图；

图4为A1-A10收集管中萤火虫荧光素酶的酶活力测定结果图。

具体实施方式

下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。

一种萤火虫荧光素酶基因，是通过将野生型的萤火虫荧光素酶基因的第31位赖氨酸突变为丙氨酸后得到的mutLuc基因。

进一步的，所述野生型的萤火虫荧光素酶基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1，所述丙氨酸的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2。

一种萤火虫荧光素酶基因用于生产萤火虫荧光素酶中的应用。