[发明专利]一种奶牛怀孕胶体金检测试纸条

说明书

技术领域

本发明是一种奶牛怀孕胶体断检测试纸条，是一种可以简单、高效地进行早期妊娠诊断试验。可应用于奶牛早期妊娠诊断。 

背景技术

胶体金免疫层析技术（Gold immune-chromatography assay, GICA）是一种将胶体金标记技术、免疫检测技术和层析分析技术等多种方法有机结合在一起的固相标记免疫检测技术。它是以胶体金为标记物，利用特殊的抗原抗体反应和固相膜系统进行免疫检测的一种新技术。它由胶体金标记技术和固相膜免疫测定系统组成。 

胶体金标记技术是上世纪发展起来的四大免疫标记技术之一，被广泛应用于电镜、流式、分子生物学甚至是生物芯片中，在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。由于该技术操作简单方便、能在3-10 分钟内完成检测，结果直观易懂，且其特异性、灵敏度和稳定性均与酶联免疫吸附法（ELISA）法不相上下，不仅在临床诊断和医学检验中得到广泛使用，更适合开发成方便快捷的临床筛查及家庭自检产品，如早孕试纸、乙肝检测、血糖检测、毒品检测、药物残留、食品安全检测等，具有极大的产业化前景，成为生物技术领域一大开发热点。 

与传统的实验室诊断方法，如ELISA 法、免疫比浊法、放免法相比，胶体金免疫层析技术具有其独特的优势： 

1）操作简单，一步完成，无需专门技术人员操作；

2）检测快速，一般3 到10 分钟内即可完成检测；

3）结果直观，检测结果无需专业技术人员分析；

4）检测无需依赖仪器，携带方便，产品室温保存，无需冷藏；

5）成本低。

结合上述胶体金技术的特点，我们就可以发现该技术特别适用于犬、猫、牛、羊、猪、鸡等动物养殖疾病防治。 

发明内容

简便而有效的奶牛早期妊娠诊断方法是养牛生产者及畜牧兽医工作者长期以来亟待解决的问题。1958年．Short发现奶牛外周血浆中孕酮浓度的变化可以反映母牛所处的生殖状态。后来，Laing和Heap(1971)首次利用孕酮的RIA检测法．证实了奶牛乳汁和血浆中孕酮的水平所反映的发情周期各阶段与直肠检查法所评估的结果相一致。我公司对孕酮免疫原合成和单克隆抗体制备有了重大进展．获得了针对孕酮小分子半抗原两个不同抗原决定簇的单克隆抗体．实现了对奶牛乳汁中孕酮激素含量的高灵敏度检测。在此基础上，用胶体金双抗夹心法研制了奶牛早孕诊断试纸，进行早期妊娠诊断试验。 

将胶体金颗粒标记到能够识别奶牛孕酮的捕获抗体，成为金标抗体，并将金标抗体加到“胶金垫”上。而包被抗体则是能够识别奶牛孕酮的另一表位的抗体，将包被抗体包被固定在T线位置。二抗是指能够识别金标抗体的抗体，将二抗包被固定在C线位置。当将待诊断样品滴加到样品垫上，样品就会沿着层析方向泳动，当经过胶金垫时，奶牛孕酮就会被金标抗体识别并特异性结合，从而一起向前泳动。当经过T线时，就会被固定在此处的包被抗体捕获，从而被留在此处，随着金颗粒的累积从而变色。剩余的金标抗体则继续向前泳动，被固定在C线位置的二抗捕获，被留下来，随着金颗粒的积累从而变色。所以当牛奶样本中孕酮含量达到设定的阈值时，T线、C线都显色。否则，金标抗体不能被留在T线，而全部被C线处的二抗捕获留下来。从而T线不显色，C线显色（图1）。 

附图说明

图1是胶体金试纸条检测原理示意图 

具体实施方式

1.实验材料 

①奶牛孕酮标准品1（公司自制） 

②奶牛孕酮标准品2（购自SIGMA） 

③孕酮单克隆抗体：YT2013001、YT2013002(公司自制) 

④羊抗鼠多克隆抗体（公司自制） 

以上是主要实验材料，还包括一些常规实验试剂、仪器等。 

实验方法

①  胶体金液的制备：

先将0.01%的haucl4溶液加热至沸腾，迅速加入一定量1%柠檬酸三钠水溶液，开始有些蓝色，然后浅蓝、蓝色，再加热出现红色，煮沸7～10min出现透明的橙红色。各种颗粒的胶体金制备详见表1.