[发明专利]一种感受态宿主细胞的制备方法以及一种快速高效将外源物质转入宿主细胞的方法及其应用

权利要求书

1.一种感受态宿主细胞的制备方法，包括以下步骤：

1）纯化、复苏及预处理宿主细胞；

2）用真空冷冻干燥技术处理宿主细胞，得到感受态宿主细胞。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述宿主细胞为任意一种原核或真核宿主细胞，包括细菌细胞、真菌细胞、植物细胞和动物细胞等，例如为大肠杆菌和酵母。

3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于：步骤1）所述纯化宿主细胞是指将原宿主细胞在固体培养基表面划线培养，得到单克隆；复苏宿主细胞是指将纯化的宿主细胞重新培养一定时间，使其从静止状态重新进入到生长状态；预处理宿主细胞是指将复苏的宿主细胞扩大培养至相应浓度。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于：步骤1）纯化、复苏及预处理宿主细胞的过程如下：

（1）纯化宿主细胞：用接种环取原始宿主细胞分区划线接种于适用于培养宿主细胞的固体培养基，在适宜条件下培养，得到宿主细胞单克隆；针对大肠杆菌的为LB固体培养基，其配方为胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，琼脂粉15g/L；针对酵母的为YPD固体培养基，其配方为酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L；适于大肠杆菌的培养条件为37℃，12～16h；适于酵母的培养条件为30℃，48h；

（2）复苏宿主细胞：挑取宿主细胞单克隆接种到5mL适用于宿主细胞的生长培养基中，在适宜温度下（大肠杆菌37℃；酵母培养30℃）220rpm复苏过夜（12～16小时）；适于大肠杆菌的为LB培养基，其配方为胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L；适于酵母的为YPD培养基，其配方为酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L；

（3）预处理宿主细胞：将经复苏的宿主细胞按照体积比1:100的比例接种到100mL新鲜的步骤（2）所述的生长培养基中，在适宜温度下（大肠杆菌37℃；酵母培养30℃）220rpm摇菌至OD₆₀₀=0.6～1.0；吸取500μｌ菌液分装至1.5mL EP管中，-80℃冰箱预冷冻12～24小时以上。

5.根据权利要求1至4任一所述方法，其特征在于：步骤2）所述真空冷冻干燥技术处理，是将步骤1）处理后的宿主细胞用真空冷冻干燥仪预冷30～120分钟待温度达到-54℃并稳定在该温度后，再真空冷冻干燥宿主细胞12～24小时或以上。

6.权利要求1至5任一所述方法制备得到的感受态宿主细胞，且所述感受态宿主细胞在0-4℃温度下仍具备生物活性。

7.一种将外源物质转入宿主细胞的方法，利用权利要求1至5任一所述方法制备得到的感受态宿主细胞，进一步包括以下步骤：

3）制备待转化的外源物质的水溶液；

4）用所述水溶液对步骤2）得到的感受态宿主细胞进行快速复水，得到已转化有外源物质的宿主细胞菌液；

以此将外源物质转入宿主细胞。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所用外源物质包括核酸（脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)）、蛋白质、寡肽、氨基酸等生物活性物质。

9.根据权利要求7或8所述方法，其特征在于，所述步骤3）中所述外源物质水溶液使用ddH₂O，配制好的外源物质水溶液在37℃水浴锅中保温30～60分钟。

10.根据权利要求7或8或9所述方法，其特征在于，步骤4）快速复水的操作为：将步骤2）的感受态宿主细胞迅速加入步骤3）配制的外源物质的水溶液，轻轻混匀后置于适宜温度下（大肠杆菌37℃；酵母培养30℃）恒温箱中220rpm振荡培养45～60分钟；外源物质水溶液的用量与冷冻干燥前的宿主细胞等体积。

11.一种生成外源物质转化菌的方法，其特征在于，用条件培养基筛选权利要求7至10任一所述方法得到的已转化有外源物质的宿主细胞，得到的单克隆即为外源物质转化菌。