[发明专利]一种高灵敏度检测和鉴定人多瘤病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种病原微生物的检测方法，特别涉及一种高灵敏度检测和鉴定人多瘤病毒的方法。

背景技术

多瘤病毒是双链DNA病毒，基因组约4700-5400碱基对，编码结构蛋白和抗原。自Gross于1953年发现鼠多瘤病毒可引发鼠肿瘤以来，多瘤病毒一直被怀疑是人类肿瘤的致病因素。然而，虽然多瘤病毒感染能够在动物模型中诱发肿瘤，但是一直没有发现引起人类肿瘤的确切证据。在动物中，多瘤病毒DNA整合入宿主基因组经常先于肿瘤形成。

截止2013年3月，已发现的人多瘤病毒有12种。1971年报道的BK polyomavirus(BKPyV)和JC polyomavirus(JCPyV)被视为最早发现的人多瘤病毒。BKPyV被认为与肾病和膀胱炎有关；JCPyV则与进行性多灶性脑白质病有关；2007年，KI polyomavirus(KIPyV)和WU polyomavirus(WUPyV)从呼吸道分离出来，但其致病性仍不清楚。美国学者Feng于2008年在《Science》杂志首次报道，从人类Merkel细胞瘤(简称MCC)样本中检测到未知病毒T抗原和人酪氨酸磷酸酶受体的融合基因转录本。经过鉴定和序列分析发现其为一个之前未知的多瘤病毒，含有5387个碱基对基因组，他们将之定名为Merkel细胞多瘤病毒（Merkel cell polyomavirus，MCV或MCPyV)，成为首个被确定为与恶性肿瘤相关的人类多瘤病毒（Feng et al.2008）。由于MCPyV存在的拷贝数极其低，平均一个细胞仅含有一个病毒颗粒，一般技术难以检测到。美国国立肿瘤研究所（NCI）的学者Schowalter等发明了一种改进的滚动循环扩增（rolling circle amplification，RCA）技术，从皮肤拭抹样本中分离到环型DNA病毒基因组，完整的MCPyV基因组可以从40%(14/35)的健康成人中获得。RCA分析还揭示了2个以前未知的多瘤病毒称为human polyomavirus6(HPyV6)and HPyV7，在健康人样本中检测到HPyV6（5/35）和HPyV7DNA（4/35）。经血清学研究发现，在95名献血员的血清中检出61%(58/95)MCPyV阳性，69%(66/95)HPyV6和35%（33/95）HPyV7阳性，该结果表明，这3种病毒的单独感染或共感染非常普遍(Schowalter et al.,2010)。荷兰莱顿大学的学者van der Meijden于2010年从心脏移植病人面部粉刺皮肤病中分离到一种多瘤病毒trichodysplasia spinulosa-associated polyomavirus(TSPyV)（van der Meijden et al.,2010），成为第8种人类多瘤病毒。德国学者Scuda于2010年从肾移植免疫抑制治疗病人的血浆中检测到一个新的多瘤病毒，序列分析显示最靠近的亲缘关系为非洲绿猴起源的淋巴多瘤病毒，该病毒自然地感染人类，被命名为HPyV9(Scuda et al.,2011)。2012年，美国学者分别从粪便，患WHIM综合征，包括特征性的疣(warts)、低丙种球蛋白血症(hypogammaglobulinemia)、细菌感染(recurrent bacterial infection)和先天性骨髓粒细胞缺乏症(myelokathexis)病人皮肤中发现了第10种多瘤病毒MW polyomavirus(MWPyV),HPyV10和MX polyomavirus(MXPyV)（Lim et al.,2012,Buck et al.,2012,Yu et al.,2012)。序列分析表明MWPyV,HPyV10和MXPyV属于同一种人多瘤病毒。美国华盛顿大学Lim于2012年从美国和非洲儿童粪便中检出一种新的多瘤病毒STL polyomavirus(STLPyV)，检出率约为1%，成为第11种人多瘤病毒（Lim et al.2012）。2013年，德国学者Korup等从人类肝组织中发现第12种人多瘤病毒，HPyV12(Korup,et al.2013)。

在已发现的12种人多瘤病毒中，至今已有4种人多瘤病毒确定与人类疾病相关（BKPyV,JCPyV,MCPyV和TSPyV），并且发现存在多种多瘤病毒共同感染的状况。然而，目前的人多瘤病毒DNA检测方法，还停留在单个病毒特异性PCR或荧光定量PCR检测阶段，尚未见有囊括多种人类多瘤病毒检测的方法报道。由于检测通量低，严重影响了人多瘤病毒与人类疾病关系的深入研究。

发明内容