[发明专利]一种来源于矮沙冬青的钼辅助因子硫酸化酶的基因序列及其克隆方法

权利要求书

1.一种来源于矮沙冬青的钼辅助因子硫酸化酶的基因序列，该基因具有如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的序列，其特征在于：该基因所述的核苷酸序列对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述。

3.依照权利要求1所述的一种来源于矮沙冬青的钼辅助因子硫酸化酶基因序列的克隆方法，包括下述主要步骤：

（1）总RNA的提取和纯化：

采用各种通用的RNA提取方法和纯化方法，从植物矮沙冬青叶片中提取得到纯化的矮沙冬青叶片总RNA。

（2）中间片段的克隆：

A、中间片段cDNA第一链的合成

以上述步骤（1）纯化的矮沙冬青叶片总RNA作为模板，以含有接头的3′RACE Adaptor引物进行反转录，得到的cDNA第一链，作为下述步骤B中PCR扩增的模板。

B、PCR扩增

以前述步骤A所得中间片段的cDNA第一链作为模板，利用下述上游引物jf1和下游引物jx1，进行PCR扩增。

扩增得到矮沙冬青的钼辅助因子硫酸化酶基因cDNA中间片段，通过克隆测序，得到中间片段序列。

（3）3′端的克隆：

C、3’-outer PCR扩增

根据上述步骤（2）得到的中间片段序列，设计并合成特异性上游引物GSP1-3′-outer，以前述步骤（2）A所得的cDNA第一链为模板，利用特异性上游引物GSP1-3′-outer和3′端下游引物3′-RACE outer，进行3′端outer PCR扩增：

扩增得到的产物为cDNA 3′端。

D、3’-inner PCR扩增

根据前述步骤（2）所得中间片段端序列，设计并合成特异性上游引物GSP1-3′-inner，以前述步骤C所得3′端的outer PCR产物模板，利用特异性上游引物GSP1-3′-inner和3′端下游引物3′-RACE inner，进行3′端inner PCR扩增：

扩增得到的产物为cDNA 3′端inner PCR产物，通过克隆测序，得到3′端完整序列。

（4）5′端的克隆：

E、合成5′端的cDNA第一链：

以上述步骤（1）纯化的矮沙冬青叶片总RNA作为模板，对RNA进行预处理，加入含有接头的5′ RACE Adapter引物进行反转录：

合成得到反转录产物5′端的cDNA第一链。

F、5’-outer PCR扩增

根据上述步骤（2）得到的中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP1-5′-outer，以前述步骤E所得反转录产物的cDNA第一链为模板，利用特异性下游引物GSP1-5′-outer和5′端上游引物5′-RACE outer，进行5′端outer PCR扩增：

扩增得到的产物为cDNA 5′端。

G、5’-inner PCR扩增

根据前述步骤（2）所得中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP1-5′-inner，以前述步骤F所得5′端的outer PCR产物模板，利用特异性下游引物GSP1-5′-inner和5′端上游引物5′-RACE inner，进行5′端inner PCR扩增：

扩增得到的产物为cDNA 5′端inner PCR产物，通过克隆测序，得到5′端完整序列。

（5）cDNA全长序列拼接和克隆：

将上述步骤（2）所得中间片段、步骤（3）所得3′端inner PCR扩增序列和步骤（4）所得5′端inner PCR扩增序列进行完整序列的拼接，即完整的基因序列。

（6）钼辅助因子硫酸化酶基因的克隆：

将上述步骤（4）合成5′端的cDNA第一链作为模板，根据上述步骤（5）的基因分析设计上游引物ORF1-S和下游引物ORF1-A，并进行PCR扩增：

扩增得到的产物为完整的矮沙冬青的钼辅助因子硫酸化酶基因，通过克隆测序，即得其基因序列。

4.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于：所述的步骤（1）中，采用的RNA提取方法为试剂盒法；纯化方法为DNA酶消化法。