[发明专利]一种检测乳腺癌的microRNA标志物及在试剂盒中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术诊断领域，尤其涉及一类用于检测乳腺癌的microRNA标志物及应用。

背景技术

microRNA是一类长度约为20-24nt的具有调控功能的非编码RNA。其主要参与基因转录后水平的调控。

microRNA具有以下特点：①细胞特异性：不同组织不同细胞microRNA的表达谱特征不同；②“时空”特异性：细胞在不同发育阶段，microRNA组成不同；③保守性：不同种属、不同组织器官以及不同细胞之间相同的microRNA分子具有相似的调控功能；④稳定性高：microRNA在PH改变，DNA以及RNA裂解酶的作用下，不易降解，具有很高的稳定性。因此microRNA是天然的优秀生物标志物，已有报道不同microRNA被实验室确认为一些恶性疾病的分子标志物。

2010年2月，血浆（或血清）miR-92被成功用作结直肠癌的分子标志物，灵敏度可达89%，特异性达到70%，且肿瘤切除后miR-92的表达量较术前显著降低。血清miR-92作为分子标志物可以诊断Ⅰ～Ⅳ期的结直肠癌，早期诊断可以大大提高生存率和改善预后效果。在舌鳞状上皮细胞癌的研究中发现，miR-184在癌组织中的表达提高了59倍以上，患者术后的血浆（或血清）miR-184表达量降低到只有原来的1/10，这表明血浆（或血清）中microRNA表达谱的变化与肿瘤组织关系密切，血浆（或血清）microRNA表达谱有可能替代组织microRNA表达谱作为肿瘤标志物。

虽然疾病组织microRNA表达谱往往与疾病发病及预后密切相关，但是检测技术复杂、创伤大，难以真正应用于临床诊断，且不同的microRNA对不同疾病的诊断特异性差异较大。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测乳腺癌的microRNA标志物，通过在microRNA的3，尾部添加PolyA尾，通过反转录PCR及荧光定量PCR的方法特异性的来检测被测者血清或血浆中该microRNA的含量，并与正常microRNA水平比较来诊断乳腺癌，该microRNA特异性和灵敏度高。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种检测乳腺癌的microRNA标志物，所述microRNA标志物为序列为SEQ ID NO：1所示，其标号为miRNA-27a。也可以为与所述SEQ ID NO：1所示序列互补的microRNA。

本发明的有益效果是：筛查出的miRNA-27a标志物作为用于检测乳腺癌的特异性和灵敏度高。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

本发明还包括权利要求1所述的一种检测乳腺癌的microRNA标志物在制备乳腺癌的诊断试剂中的用途。

具体的使用在microRNA的3，尾部添加PolyA尾，通过反转录PCR及荧光定量PCR的方法来检测被测者血清或血浆中miR-27a的含量，并与正常人miR-27a水平比较来诊断乳腺癌。

本发明进一步提供一种用于检测乳腺癌的诊断试剂盒，包括在权利要求1所述microRNA标志物的3’尾部添加PolyA所需的试剂、cDNA合成试剂及荧光定量PCR试剂，所述荧光定量PCR试剂中包括权利要求1所述microRNA的特异性正向引物。

进一步，所述荧光定量PCR试剂包括所述microRNA为序列为SEQ ID NO：1的特异性正向引物序列为5’-GGGTAGCAGCACA-3’（SEQ ID NO：2所示）。

荧光定量PCR试剂包括下列试剂：RNase-Free Water，10xUPM(1uM)，2xqPCR Mix，ROX，ROX II，Mineral Oil。

所述荧光定量PCR试剂中包括序列分别为5’-CTCACACGA CTCACGA CAC-3’（SEQ ID NO：6）和5’-CTCACACGACTCACGA CACCA GTGG TATCAACGCACTC-3’（SEQ ID NO：7）的通用反向引物UPM-short和UPM-long。

进一步，还包括从血清或者血浆中提取总RNA的试剂。

所述提取总RNA的试剂包括标号为Cel-mir-67的控制外参-1，其序列为5’-CAACCTCCTAGA-3’（SEQ ID NO：3）的控制外参-1。