[发明专利]利用DFNA5基因调控区两个甲基化位点作为乳腺癌早期分子筛查的标记物

说明书

所属技术领域

本发明涉及一种乳腺癌早期分子筛查的标记物。DFNA5基因调控区两个甲基化位点可用于乳腺癌早期筛查的一个预警标记。 

背景技术

乳腺癌是全球妇女最常见的恶性肿瘤，定期的乳腺X线检查可以降低40岁以上妇女乳腺癌的死亡率，因此是迄今为止唯一证实有效的乳腺普查措施。尽管乳腺X线检查在乳腺癌的早期发现中具有较高的应用价值，但它可能存在漏诊，而且在判断异常病灶的良恶性方面的应用价值也十分有限，目前对于乳腺X线普查间歇期内发生乳腺癌是漏诊还是新发生的病例尚无有效的区分方法。所以，一种简单、迅速、廉价的乳腺癌早期筛查方法将会为中国数以亿计的妇女造福。 

DNA甲基化是一种表观遗传修饰，它是由DNA甲基转移酶(DNA methyl-transferase，Dnmt)催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶(mC)的一种反应，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位点，它在基因组中呈不均匀分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的区域，在哺乳动物中mC约占C总量的2-7％。一般说来，DNA的甲基化会抑制基因的表达。甲基化的模式是当前研究的重要课题。在正常组织内，基因的甲基化主要分布在缺少CpG位点的编码区。 

肿瘤的特征是不平衡的甲基化。在肿瘤中，伴随基因组的低甲基化是区域性的高甲基化，及DNA甲基化转移酶的基因表现上升。有证据显示基因组的低甲基化可以导致染色体的不稳定及增加突变机会，在细胞中的整体甲基化状态可能是引发癌症的促进因素。某些基因的甲基化状态会是肿瘤生成的生物标志，比如说，谷胱甘肽S转移酶Pi基因的甲基化已被建议作为前列腺癌的诊断指标。环境因素(厨房油烟，汽车尾气等)会改变表观遗传形状(CpG甲基化或去甲基化)，造成基因不正常的表达或沉默。普遍认为，这种变化可能与癌症的起因有直接的关系。 

我们认为，DFNA5基因调控区CpG的甲基化程度与乳腺癌的发病有直接关系，可能成为早期乳腺癌分子筛查的分子标记物。 

发明内容

本发明利用Illumina芯片对人全基因组27332个CpG位点的甲基化状况进行探测，用两个乳腺癌细胞系进行扫描得出结果。如下表所示，数据显示DFNA5基因调控区CpG的甲基化程度明显低于其它基因调控区的CpG岛。我们认为，这种低甲基化与乳腺癌细胞的快速生长有密切关系。因此，我们可能通过检测此CpG岛的甲基化程度，预警乳腺癌的发病。 

本发明所述两个甲基化位点在人基因组的位置(DNFA5基因Exon1在人第七染色体上的位置)如下： 

DNFA5Exon1(Chromosome7)： 

Start position24，763，851 

End position24，764，165 

cg24805239： 

CpG position24，764，011 

SourceSeq： 

CGGTTCAACCAGGAAAGTCCAAGGCCTGTCCAGCCTGTGGGAGCCCCTAA 

cg04770504： 

CpG position24,763,888 

SourceSeq： 

TCGGGACTCACCCGGGAGATGTCGGGGCCTCTCGGGAAGAGTGGGCTGCG 

具体实施方式

DNA甲基化：是由DNA甲基转移酶催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶的表观遗传修饰，常见于基因的5′-CG-3′序列，它在人的正常发育、X染色体失活、衰老、肿瘤及许多疾病过程中发挥重要作用。 

Infinium Methylation Assay：利用重亚硫酸盐转化胞嘧啶→尿嘧啶原理检测gDNA是否被甲基化。重亚硫酸盐作用于gDNA后，gDNA中未被甲基化的胞嘧啶将转变为尿嘧啶，而已经甲基化的胞嘧啶仍然保持原样。Infinium Methylation Assay设计的两条位点特异性探针，一条与甲基化的位点配对，一条与未甲基化的位点配对，配对后的探针单碱基延伸，随后荧光试剂染色，gDNA甲基化程度就可以通过捕捉到的荧光信号来判断。 

Day1： 

Start Bisulfite Conversion 

事先准备工作：