[发明专利]粘质沙雷氏菌锚定蛋白重复子及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种粘质沙雷氏菌锚定蛋白重复子。 

背景技术

锚定蛋白最早是在各种真核生物中发现，是一种广泛存在的受体蛋白，典型的锚定蛋白包括四个部分：锚蛋白重复子组成的结合域，隐蛋白结合域，致死域和C-末端域。研究表明，锚蛋白重复子结构广泛存在于各种细胞和组织中，一般认为锚蛋白重复子参与蛋白间相互作用。原核细胞中也存在大量的锚蛋白重复子，参与各种分子内和分子间的相互作用，在某些病原菌如嗜肺军团菌和立克次氏体中，锚蛋白重复子还参与效应蛋白的分泌。在粘质沙雷氏菌中也存在这样的锚蛋白重复子，经比对此锚蛋白重复子序列在粘质沙雷氏菌和耶尔森氏菌中氨基酸相似度较高。目前关于粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子还尚未有相关的研究。 

发明内容

本发明提供了粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子的序列，并研究了其在宿主菌中的作用，以及其对磷脂酶A1在大肠杆菌中表达时的作用。 

本发明的第一个目的是提供粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子，所述重复子序列为SEQ ID NO：2所示序列。 

本发明的第二个目的是提供粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子在宿主菌中的应用。 

所述应用为锚蛋白重复子在宿主菌中表达时对宿主菌的抑制作用。 

所述应用为锚蛋白重复子与磷脂酶A1在宿主菌中共表达时对宿主菌的抑制作用。 

所述宿主菌为大肠杆菌。 

本发明的第三个目的是提供粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子对磷脂酶A1在大肠杆菌中表达中的应用。 

所述应用为粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子对磷脂酶A1在大肠杆菌中表达时起促进作用。 

本发明的第四个目的是提供一种重组载体，其含有权利要求1所示的粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子，例如所述载体可以是pET-28a（+）。 

本发明的第五个目的是提供一株重组菌株，其含有权利要求1所示的粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子。 

将锚蛋白重复子基因导入大肠杆菌中构建基因工程菌，发现锚蛋白重复子单独表达及与磷脂酶A1基因共表达时均对宿主菌的生长具有明显的抑制作用。可发现粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子的表达对宿主菌具有明显的抑制作用，不论是其单独表达还是和其他基因共表达。 

将锚蛋白重复子与磷脂酶A1基因在大肠杆菌中共表达时，可发现，粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子对磷脂酶A1基因在大肠杆菌中的高活性表达具有较大的促进作用。本发明为粘质沙雷氏菌致病机制及进一步提高磷脂酶A1活性的研究提供了一个新的思路。 

附图说明

图1为重组质粒plaS-pET-28的构建示意图； 

图2 为在IPTG诱导和无IPTG诱导条件下plaS-pET-28/BL21的生长曲线；

图3 为plaA-pET-28、plaA-plaS-pET-28质粒图谱；

图4 为在IPTG诱导和无IPTG诱导条件下plaA-pET-28/BL21和plaA-plaS-pET-28/BL21的生长曲线；

图5为粘质沙雷氏菌PL-06镜检图片；

图6为锚蛋白重复子序列的蛋白结构域预测图；

图7为锚蛋白重复子序列的三级结构预测图。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。 

材料和试剂： 

所用限制性内切酶，T4 DNA连接酶，PCR试剂，质粒提取试剂盒，PCR产物纯化试剂盒等均购于上海生工生物工程公司；引物合成和测序由上海英骏生物技术有限公司完成；其他试剂均为国内或国外购买的分析纯试剂。

KLB培养基的制备方法：1%（W/V）胰蛋白胨，0.5%（W/V）酵母提取物，1%（W/V）氯化钠，NaOH调pH值至7.2，121℃灭菌20min。待冷凉至50~60℃时加入终浓度为50μg/mL的卡那霉素。 

实施例1 粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子的制备

取出从4℃冰箱中保藏的粘质沙雷氏菌PL-06，挑取单克隆接种至LB液体培养基中， 37℃，200r/min过夜培养10-12小时经显微镜观察及16SrDNA鉴定，证实与GenBank中公布的各种粘质沙雷氏菌的16SrDNA的同源性为99%，从而确定该菌株为粘质沙雷氏菌，镜检图片如图5，16SrDNA序列如序列表中序列1，genbank登录号：JX138534。