[发明专利]基于颜色的环介导逆转录等温扩增技术检测人感染甲型H7N9流感病毒基因

说明书

发明领域

本发明是用基于HNB颜色的环介导逆转录等温扩增技术检测人感染甲型H7N9流感病毒的H7基因和N9基因。用于各级疾病预防控制机构，流感检测网络实验室，哨点医院对人感染甲型H7N9流感病毒的检测和监测。

发明背景

H7N9流感病毒是一种新型的重组甲型流感病毒，其基因是来自于东亚地区野鸟和中国上海、浙江、江苏鸡群的基因重配型。该病毒之前仅发现于鸟禽间，但是2013年3月底在上海和安徽两地全球首次报道了人感染H7N9流感病毒病例。这种病毒的传播途径主要经呼吸道传播，也可通过接触带病毒禽类分泌物或排泄物等被感染，直接接触病毒也可被感染，但是目前还尚无人与人之间传播的确切证据。易感人群以与禽类养殖、销售、宰杀、加工以及在发病前1周内接触过禽类的成年人为主。截止2013年5月6日，全国(含台湾省)已确诊甲型H7N9流感130例，31人死亡，42人痊愈。病例分布于北京、上海、江苏、浙江、安徽、山东、河南、台湾、福建等地。鉴于我国甲型H7N9流感疫情不断扩大的局面，为有效阻止疫情的更大范围传播和疫情及时应急处置，根据卫生部应对甲型H7N9流感疫情防控要求，我国已决定在各地增加病毒检测实验室和哨点医院，扩大监测网络的覆盖范围。将网络实验室扩大到整个地市一级，目标是使全国300多个地市都具备能够进行病毒检测的能力，及早发现和确诊甲型H7N9病例，尤其严密监测其人传人流行性调查，切实有效地做到早发现、早报告、早处置。本专利成功建立的基于颜色的RT-LAMP检测人甲型H7N9流感病毒基因方法，将为提高我国流感监测网络实验室和哨点医院的监测能力，实现对发热病人的快速筛查提供了有力的技术保障。

与传统基因分子诊断方法相比，基于颜色的RT-LAMP技术在RNA病毒检测方面有着无法比拟的优势，尤其在可操作性和设备要求方面。这种优势的存在主要是因为RT-LAMP技术如下几个方面的特点：第一，检测时间短灵敏度高。整个检测时间可缩短至1～1.5小时内，灵敏度可与实时荧光定量PCR媲美。第二，特异性高。所设计的六条特异性引物，只在其与识别靶序列中八个结合区完全匹配的情况下扩增才能顺利进行，因此这很大程度上减少了非特异性扩增反应的可能，从而使检测特异性更为可靠。第三，设备要求简单。扩增反应在60～65℃恒温条件下进行，无核酸变复性过程，除了应用一些常用聚合酶外，对硬件设备基本无特殊要求，普通级别下的生物实验室即可完成检测和结果判断。第四，污染机会低。在实施过程中只需一步就可完成实验操作，减少了污染机会并方便了实验过程中的质控工作。同时，该技术于反应前加入显色染料，避免了常规RT-LAMP的后续开盖行为，有效地防止了气溶胶污染。第五，结果可视化。RT-LAMP扩增反应过程中可产生大量副产物焦磷酸镁白色沉淀，或在扩增前加入一定量羟基萘酚蓝(HNB)，使得阳性反应管中出现可视的白色混浊物或反应管内颜色变化，从而实现检测结果的直接可视化判定。

发明内容：

1.本发明是对目前对RNA病毒检测技术手段的改进和补充，它具有安全、特异、灵敏、便捷的优势。这主要体现在以下几个方面。首先，检测时间短灵敏度高。整个检测时间可缩短至1～1.5小时内，灵敏度可与实时荧光定量PCR媲美。其次，特异性高。所设计的六条特异性引物，只在其与识别靶序列中八个结合区完全匹配的情况下扩增才能顺利进行。然后，所有的扩增过程都可在63℃等温下完成，无需PCR仪，降低了对实验硬件的要求。最后，污染机会低和结果可视化。。

2.选择人感染甲型H7N9流感HA基因(GISAID：EPI439507)的288～483位和NA基因(GISAID：EPI439509)的151～352位的相对保守区设计相应的RT-LAMP引物，针对每个基因分别包括两条外引物(F3、B3)和两条内引物(FIP、BIP)，两条环结合引物(Loop1、Loop2)。所有引物的具体序列见表1和表2。

表1：RT-LAMP检测人感染甲型H7N9流感H7基因的引物序列