[发明专利]一种基因工程改造的蓝藻及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程改造领域，具体的说涉及一种基因工程改造的蓝藻及其用途。 

背景技术

2,3-丁二醇（2,3-butanediol，23BD），分子式结构示意图为：23BD广泛用于化工、食品、航空航天燃料等领域。其脱水产物甲乙酮可作树脂、油漆等的溶剂；酯化后的脱水产物1,3-丁二烯可用于合成橡胶、聚酯和聚亚胺酯；热值较高(27,200kJ/kg)可作为燃料添加剂，也可作为乙醇的替代品；与甲乙酮脱氢形成辛烷异构体可生产高级航空用油；BD还可制备油墨、香水、熏蒸剂、增湿剂、软化剂、增塑剂、炸药及药物手性载体等。 

目前生产2，3-丁二醇的方法主要有化学法和生物转化法。 

目前化学法生产2，3-丁二醇主要以石油裂解产生的四碳类碳氢化合物在高温、高压下水解得到的。该方法难度大，生产成本高，过程繁琐，不易操作。需要石油资源作为原材料。同时生产厂房庞大，对环境污染重。 

目前生物转化法生产2，3-丁二醇大多数用葡萄糖作为碳源，而葡萄糖的价格较高，且存在与人争粮、与粮争地的问题。生产菌株有多种细菌，例如多粘拟芽孢杆菌，这种生产方法实际上是一种转换，而非生产。 

蓝藻是一种最原始的原核藻类，兼有植物和细菌的一些特性，开发蓝藻作为微藻基因工程受体受到越来越多的学者关注。蓝藻作为外源基因的表达受体具有以下优点：(1)培养条件简单，成本低廉，只需光、C02、无机盐、适当温度就可以获得大量藻体，能采用连续、静止等多种培养方式；(2)与高等植物相比，蓝藻的遗传背景简单，除了裸露的染色体DNA外，不含叶绿体和线粒体DNA，便于基因分析和检测外源DNA；(3)细胞壁主要由肽聚糖组成，没有类似于高等植物细胞壁的纤维素成分，便于外源DNA分子的转化；(4)多 数蓝藻种类含有内源质粒，这为构建穿梭质粒载体提供了极好的条件；(5)与常用的基因工程受体(大肠杆菌和酵母菌)相比，蓝藻细胞体积较大，能耐受高浓度(总蛋白的25％)的单一蛋白，而在大肠杆菌中仅为5％，内源蛋白更新速度低，对外源蛋白质的容纳量较高； 

发明内容

本发明首先提供了一种pLXP1质粒，该质粒含有ALS（乙酰乳酸合成酶）表达盒、ALDC（2-乙酰乳酸脱羧酶）和ADH（异丙烷醇脱氢酶(NADP+)酶）串联表达盒； 

进一步的，该pLXP1质粒种还含有卡那抗性筛选标记基因、大肠杆菌复制子和蓝藻基因组中的同源序列NS1/NS2； 

本发明还提供了一种蓝藻，将其命名为SEL1蓝藻，其是由pLXP1质粒的酶切片段电转化蓝藻PCC7942，经过同源重组，将pLXP1片段整合于蓝藻PCC7942基因组中得到。 

其中蓝藻菌种Synechococcus elongatus PCC7942来源于美国ATCC菌种库（ATCC菌种编号：33912）。 

本发明还提供了上述SEL1蓝藻的用途，其可用于23BD的生产合成，具体的方法为：光照培养SEL1蓝藻3-5天后，收集培养上清溶液，培养上清溶液中即可检测到23BD。 

本发明的SEL1蓝藻生产合成23BD的原理为： 

蓝藻天然的光合碳循环当中有一个中间产物为丙酮酸（Pyruvate），本发明的通过基因工程改造的蓝藻，因为将三个外源酶稳定持续的表达于蓝藻之中，通过三个酶的自动催化作用，可以将丙酮酸转化为2，3-丁二醇。 

三步酶催化反应如下： 

丙酮酸转化为2-乙酰乳酸（2-acetolctate），该步骤由乙酰乳酸合成酶（简称ALS酶）催化； 

2-乙酰乳酸转化为3-羟-2-丁酮，该步骤由的2-乙酰乳酸脱羧酶（简称ALDC酶）催化； 

3-羟-2-丁酮转化为23BD，该步骤由异丙烷醇脱氢酶(NADP+)酶（简称ADH酶）催化。 

本发明的主要优势： 

1）对比传统的化工生产方法该生产方法绿色环保，无需工业原料。 

2）对比于现在的细菌发酵生产方法，无需耗糖或纤维素等原材料。 

3）蓝藻的培养成本低廉，仅需在阳光充足地区有水源即可大规模生产。 

4）蓝藻在繁殖过程中无需任何额外的营养和诱导剂，即可自动生产23BD，分泌到环境液体中。 

附图说明

图1、pLXP1质粒构建过程及结构示意图； 

图2、SEL1蓝藻的PCR鉴定结果图；