[发明专利]一种宫颈癌特异差异表达的候选血浆蛋白标志物的筛选方法

说明书

技术领域

本发明专利属于分子生物学或医学诊断技术领域，涉及一种宫颈癌特异差异表达的候选血浆蛋白标志物的筛选方法。

背景技术

宫颈癌是一种妇科恶性肿瘤，而早期发现是肿瘤有效治疗的关键。维吾尔族妇女宫颈癌的发病率和和死亡率很高，列为新疆特高发肿瘤。由于现有肿瘤诊断技术固有的局限性，临床收治的肿瘤患者中，中晚期居多，治疗效果较差。肿瘤特异性差异表达基因可以成为肿瘤发生密切相关的早期预警分子标志物，是建立肿瘤早期分子诊断方法的重要前提。本发明相关的技术包括四个关键步骤：(1)收集病理确诊的肿瘤、癌前病变患者及健康对照组织标本，制备组织RNA(Ribonucleic Acid，核糖核酸)，其组织RNA一般含有信使RNA(messenger RNA，mRNA)、核糖体RNA(ribose RNA，rRNA)和转移RNA(transport RNA，tRNA)；(2)选择人类全基因组表达谱芯片，通过肿瘤与正常组织mRNA的差异表达谱分析，建立肿瘤及癌前病变组织特异性候选差异表达基因谱(mRNA谱)，并进一步在线数据库、专业软件及资源查新分析，鉴别出新的肿瘤特异性差异表达候选基因(mRNA)；(3)以组织RNA为模板，在逆转录酶催化下，合成与其mRNA互补的脱氧核糖核苷酸(complementary deoxyribonucleic acid，cDNA)；(4)设计与合成每一种mRNA序列特异性引物后，利用cDNA模板、Taq DNA聚合酶及聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)方法，检测目的基因的mRNA表达水平，筛选出mRNA表达水平上具有显著差异的候选基因，并淘汰无差异基因。在此，“引物”是指以DNA聚合酶催化反应所必需的18-22寡聚核苷酸(碱基)分子，而“逆转录反应”和“PCR”属于同一个检测步骤的连续过程，一般统称为RT-PCR。

据既往文献记载，通过宫颈癌组织的人类全基因组芯片研究，不同研究者发现了一系列宫颈癌组织特异性差异表达基因，并已公开报道。当时，人们所采用的人类全基因组表达谱芯片所含基因条数有限，而且对新疆维吾尔族妇女宫颈癌的相关研究报道几乎空白。近期，随着人类全基因组表达谱芯片技术的优化与完善，芯片所含基因种类不断增加。本发明采用新的人类全基因组表达谱芯片，对维吾尔族妇女宫颈癌组织进行筛查分析及单一基因表达水平的RT-PCR验证，发现一系列尚未报道的宫颈癌组织特异性差异表达基因。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中存在的缺陷，利用维吾尔族妇女宫颈癌及癌前病变组织RNA，通过高密度人类全基因组表达谱芯片及单一候选基因表达水平的RT-PCR鉴定，本发明提供一种宫颈癌特异差异表达的候选血浆蛋白标志物的筛选方法。

其技术方案如下：

一种宫颈癌特异差异表达的候选血浆蛋白标志物的筛选方法，包括以下步骤：

(1)临床标本收集及组织RNA制备

维吾尔族妇女宫颈鳞癌、宫颈内上皮瘤变II-III和正常对照为对象，系统收集患者病例信息和新鲜宫颈组织标本，当场取出标本后，立即液氮冻存与运输，在-80℃超低温冰箱保存，从以上组织标本中，选取病理确诊的组织标本72例，其中宫颈鳞癌25例，宫颈内上皮瘤变II-III22例和正常对照25例。所有入选病例术前均未接受放疗或化疗，平均年龄为45.2岁；

(2)维吾尔族妇女宫颈癌及癌前病变组织RNA的高密度人类基因表达谱芯片分析

21)组织RNA样品的制备

从步骤(1)收集的维吾尔族妇女宫颈病变患者组织标本中，选取病理确诊的新鲜宫颈组织共20例，其中宫颈鳞癌7例，宫颈内上皮内瘤变II-III7例，正常对照组织6例，利用RNA提取试剂盒制备组织RNA，保存于超低温冰箱-80℃；

22)取以上人类基因组表达谱芯片共20张，分别与20例宫颈组织RNA进行杂交实验，并重复三次；

23)利用LuxScan10KA双通道激光扫描仪，对杂交后的基因芯片进行扫描分析；

24)利用SAM软件，并以NC为对照，对CSCC和CIN II-III的芯片扫描数据进行处理与统计分析，其聚类分析；

25)以两倍异常绝对值差异作为量化比较的界限，获得CSCC或CIN II-III与NC之间差异表达候选基因；

(3)宫颈癌特异性差异表达候选基因的半定量RT-PCR分析

31)候选基因的选择及编码的mRNA特异性引物设计