[发明专利]抗三疣梭子蟹颗粒血细胞26.7kDa蛋白的单克隆抗体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种由杂交瘤细胞分泌的抗三疣梭子蟹（Neptunus trituberculatus）颗粒血细胞26.7kDa蛋白的单克隆抗体及其制备方法，属于蟹类细胞免疫学技术领域。 

背景技术

蟹类不具有免疫球蛋白，缺乏抗体介导的免疫系统，为非特异性免疫，其免疫防御反应主要依赖于血细胞及血淋巴中体液因子完成。血细胞通过吞噬、包囊、凝集、结节形成、胞吐、修复等完成细胞免疫过程，同时通过合成释放免疫调节因子如溶血素、酚氧化酶等协助完成体液免疫过程，血细胞在蟹类机体免疫保护过程中起着决定性作用。目前根据细胞的形态、大小和胞质内的颗粒情况将蟹类血细胞分为两大类：透明血细胞和颗粒血细胞。透明血细胞胞质内不含颗粒或含较少颗粒，细胞器稀少，核质比大；颗粒血细胞胞质内含较多颗粒，细胞器丰富，核质比小。大量研究证明透明血细胞和颗粒血细胞在机体免疫系统中都发挥重要作用，但功能不同，其中透明血细胞主要参与血淋巴的凝集反应，颗粒血细胞含有酚氧化酶和水解酶，主要参与对外来异物的吞噬和包囊。但是，针对这两类血细胞的确切功能、胚胎发育中的发生过程及参与机体免疫调控的机制等方面尚无明确结论，主要原因为无合适的分子标记物展示其发生和参加免疫反应的过程。单克隆抗体由于具有特异性强、灵敏度高、无交叉性等特点，在高等动物免疫细胞的定位、发生、分化研究中应用较广泛，现在已有针对中国对虾血细胞、栉孔扇贝血细胞等的单克隆抗体的研究报道，主要应用于血淋巴细胞的识别、鉴定、发生和分化方面的研究。因此，三疣梭子蟹颗粒血细胞蛋白单克隆抗体的制备为进一步研究颗粒血细胞与其它类型血细胞之间的关系，颗粒血细胞的分布，在胚胎发育过程中的发生、分化及免疫功能等提供新的工具。 

发明内容

本发明目的之一是提供一种由杂交瘤细胞分泌的抗三疣梭子蟹颗粒血细胞26.7kDa蛋白的单克隆抗体。 

本发明另一个目的是提供上述抗三疣梭子蟹颗粒血细胞26.7kDa蛋白单克隆抗体的制备方法。 

本发明的目的是由以下技术方案实现的： 

一种由杂交瘤细胞分泌的抗三疣梭子蟹颗粒血细胞26.7kDa蛋白的单克隆抗体，其特征 在于所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞株Crab，保藏号为：CCTCC NO:C2012196，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2013年01月07日的杂交瘤细胞分泌的。倒置显微镜下观察生长状态良好的该杂交瘤细胞大小均一、外观饱满、个体浑圆、折光性强、贴壁良好；该杂交瘤细胞具有无限分裂增殖能力；常规培养该杂交瘤细胞2～3天，其培养液颜色由桃红色转变为黄色，该培养液中即含有该杂交瘤细胞分泌的抗三疣梭子蟹颗粒血细胞26.7kDa蛋白的单克隆抗体。 

该单克隆抗体能与三疣梭子蟹颗粒血细胞发生特异性结合，并与其它组织细胞无交叉反应，与所述的单克隆抗体发生特异性结合的抗原决定簇位于三疣梭子蟹颗粒血细胞分子量为26.7kDa的蛋白上。 

一种所述抗三疣梭子蟹颗粒血细胞26.7kDa蛋白单克隆抗体的制备方法，其步骤如下：抽取三疣梭子蟹血淋巴，离心得到全血细胞；全血细胞经Percoll介质连续密度梯度分离法得到三疣梭子蟹颗粒血细胞；以三疣梭子蟹颗粒血细胞为样品进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，对26.7kDa蛋白条带进行蛋白提纯；以提纯的三疣梭子蟹颗粒血细胞26.7kDa蛋白作为抗原，免疫Balb/C小鼠；取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合；间接免疫荧光抗体法筛选阳性杂交瘤细胞株，对阳性杂交瘤细胞株进行克隆，最后筛选得到一株能稳定分泌抗三疣梭子蟹颗粒血细胞26.7kDa蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株Crab；其分泌的抗体为抗三疣梭子蟹颗粒血细胞26.7kDa蛋白的单克隆抗体（简称：单抗Crab），经流式免疫荧光法和转印免疫印迹法验证其单抗特性。 

所述的Percoll介质连续密度梯度分离法是将三疣梭子蟹全血细胞悬液铺于Percoll介质连续密度梯度的顶层，离心分离所得自上而下的第三层细胞带即为颗粒血细胞带。 

所述的间接免疫荧光抗体法是将融合杂交瘤细胞培养上清液分别与三疣梭子蟹全血细胞血滴片、透明血细胞血滴片和颗粒血细胞血滴片反应，而后避光条件下加入异硫氰荧光素（FITC）标记羊抗小鼠IgG抗体，荧光显微镜下观察、筛选抗颗粒血细胞单克隆抗体，即单抗Crab。其中结合三疣梭子蟹全血细胞、透明血细胞和颗粒血细胞这三种血细胞滴片的间接免疫荧光抗体法反应结果综合确定：该单抗仅与三疣梭子蟹颗粒血细胞发生特异性结合反应。