[发明专利]一种云南臭蛙皮肤抗氧化肽及其基因

说明书

 

技术领域

   本发明涉及医学技术领域，具体地说是提供一种云南臭蛙（Odorrana andersonii）皮肤来源的抗氧化肽及其基因。

背景技术

氧，对于地球上绝大多数生命体的生存是至关重要的，但是，通过产生各种活性氧分子，氧也是一个能损伤各种生命体的活性分子。这些活性氧分子（ROS，包括O^2-、H₂O₂ 及HO^2-、-OH 等）能引起DNA损伤、脂类过氧化、蛋白氧化，进而损伤细胞。有大量的研究报道揭示，ROS和多种人类疾病的产生有着极为密切的联系，包括多种癌症衰老、呼吸系统疾病和免疫系统疾病等。抗氧化剂，顾名思义，是指能抑制其它分子被氧化的分子。自然界中已经发现了2大类抗氧化剂，第一类是大分子量的由基因编码的蛋白质酶类，例如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等；第二类主要由小分子物质组成，如Vc、Ve等。到目前为止，已经有大量的抗氧化剂从不同的生物体中得以识别，这些抗氧化剂被广泛应用于癌症和心脏疾病的预防、食物储存以及化妆品领域中。但是，这些抗氧化剂都基本上属于上述2种类型，由于抗氧化剂具有重要的生物学功能和日常应用前景，在国外，许多科学家正在积极的寻找不同来源和不同类型的抗氧化剂。

在中国传统中药和民族药中，许多两栖类动物被作为药材而被广泛应用。目前，大量的研究报道已经揭示了许多两栖类皮肤中的药理学活性分子，例如抗菌肽、免疫调节肽、抗肿瘤肽、镇痛肽等。最新的研究报道揭示两栖类动物皮肤中存在一类新颖的抗氧化剂与传统抗氧化剂不同，其化学本质是由基因编码的多肽，分子量小，由两栖类动物皮肤分泌。目前，还只有滇蛙、大绿臭蛙皮肤中的抗氧化肽得以报道。抗氧化肽具有强大、快速的活性氧清除能力，其能最大限度的保护皮肤，使两栖类动物尽可能少的地受到日照、紫外线等诱导的自由基损伤。该成果是皮肤抗氧化领域的重大发现，对生物医学、抗氧化保护及化妆品研发等相关领域具有重要意义。

目前，已经从云南臭蛙皮肤分泌物中识别了大量的抗菌肽分子，但是，对其抗氧化肽的报道几乎没有。发明人将本发明的抗氧化肽的氨基酸全序列在蛋白质数据库中搜索，未能发现任何相同的多肽；发明人将本发明的抗氧化肽的核酸全序列在核酸数据库中搜索，未能发现任何相同基因。

 

发明内容

本发明的目的是提供一种新的具有强烈抗氧化活性的云南臭蛙皮肤抗氧化肽及其基因。

本发明的云南臭蛙皮肤抗氧化肽是中国两栖类云南臭蛙皮肤编码的一种单链条多肽，分子量为765.92 Daltons，从N端到C端的全序列为：FLCVRE。

云南臭蛙皮肤抗氧化肽的基因克隆包括：

云南臭蛙皮肤抽提总RNA，cDNA文库的构建，设计特异性引物，利用PCR方法筛选编码抗氧化肽的cDNA。其中：

正向引物为：5’- ATGTTCACCTTGAAGAAAACCCTT-3’，

反向引物为：5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-3’。

所获的阳性克隆经过基因核苷酸序列测定表明：云南臭蛙皮肤抗氧化肽由284个核苷酸编码，自5’端到3’端的全序列为（序列表1）：

atgttcacct tgaagaaaac ccttttactt cttttcttcc ttgggattat caactcatct ctctgtgaag aagaggagcg taatgctgaa gaagaggagc gtcgtgatga tcctgatgtt  cgtgatgttg aagttgaaaa gcgtttcctt tgcgttagag aatgataatt ggattggaaa tcatttgatg tggaacatca tttagctaaa tgcacatcag atgtcttata aaaaaaataa acatgttgca tacacttaaa gaaaaaaaaaa aaaaaaaaa aaaa

序列表1中第147至162位核苷酸编码云南臭蛙皮肤抗氧化肽成熟肽，从N端到C端的氨基酸全序列为： Phe Leu Cys Val Arg Glu（FLCVRE，序列表2）。

云南臭蛙皮肤抗氧化肽的制备方法：

根据编码云南臭蛙皮肤抗氧化肽的cDNA推断其成熟肽序列，用自动多肽合成仪合成其全序列。通过HPLC反相C₁₈层析柱脱盐和纯化，同时测定其纯度，用Edman降解法最终确定其氨基酸序列。