[发明专利]一种旋毛虫重组蛋白及应用

说明书

本发明公开一种重组蛋白的制备方法，特别是一种TsSerpin重组蛋白，以及这种蛋白和它的用途。本发明的TsSerpin重组蛋白的制备方法是：以猪旋毛虫肌幼虫中提取总RNA为模板，以Oligo(dT)₁₈ Primer为引物进行反转录；再用上述所得到的反转录cDNA为模板，用SEQ ID №1和SEQ ID №2为引物进行PCR扩增，得到猪旋毛虫TsSerpin基因；再经构建重组质粒、转化大肠杆菌等处理得到目标蛋白。本发明的重组蛋白可用于制备检测旋毛虫病的抗原。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，主要是旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因TsSerpin重组蛋白用于免疫诊断及疫苗研制，具体设计包括旋毛虫基因TsSerpin的cDNA克隆及其在大肠杆菌BL21（DE3）中的原核表达和反应原性的鉴定，并对TsSerpin进行分段克隆及原核表达和反应原性的鉴定表达，筛选反应原性比较好的片段用于免疫诊断。将重组蛋白用于小鼠免疫保护实验，确定其免疫保护性。

背景技术

旋毛虫病(Trichinellois)是由旋毛虫（Trichinella spp.）引起的一种危害严重的食源性人兽共患寄生虫病，可在包括人类在内的150多种动物之间广泛传播，人主要因为生食或半生食含有旋毛虫肌幼虫包囊的肉品而感染，严重时可致人死亡。旋毛虫病是一个非常重要的公共卫生问题，不仅给人类健康造成威胁，而且给畜牧业生产造成巨大经济损失。由于旋毛虫病病原传播途径复杂，宿主地理分布广泛，给该病的防制造成了极大的困难，至今仍然未得到有效的控制，而且流行范围继续扩大，已被列为再度肆虐的疾病。卫生部2001～2004年的全国人体重要寄生虫现状调查资料显示，在调查的旋毛虫病流行区的10个省（区、市）中，旋毛虫病血清阳性率为3.38%，但是西部地区的感染率要比东部地区高69.44%，该病已经成为影响我国食品安全和人民健康的重要因素之一。旋毛虫的抗原成份极其复杂，且不能进行体外的大量培养和繁殖，因此给该病的免疫诊断及预防带来了困难。随着分子生物学技术在寄生虫病研究中的应用，基因重组抗原成了当前研究的焦点。目前通过基因工程方法获得的旋毛虫抗原主要有46 kDa、49 kDa、53 kDa等，其重组抗原具有反应原性，可以被感染动物血清识别，但在旋毛虫感染早期诊断仍然不理想。解决诊断抗原的途径之一就是筛选鉴定旋毛虫不同发育时期的抗原表位进行融合表达以获得特异、敏感的诊断抗原。

发明内容

本发明的目的是为了克服当前旋毛虫病免疫诊断技术中的不足，即旋毛虫肌幼虫排泄分泌（ES）抗原大量制备相对较难，从旋毛虫肌幼虫中获得TsSerpin基因，对TsSerpin进行反应原性分析，并确定TsSerpin的抗原表位区域。同时对TsSerpin进行免疫诊断和保护性试验研究，为旋毛虫的诊断和预防奠定基础。

本发明提供了旋毛虫TsSerpin基因的原核表达、蛋白纯化以及反应原性鉴定的方法，其特征在于，包括：

（1）设计引物——设计的TsSerpin表达引物分别为：上游引物SEQ ID №1：（5’-GGCGAATTCATGGAAACAGAAATTGCAA-3，斜体加黑部分为EcoR I酶切位点）；下游引物SEQ ID№2：5’-CCCTCGAGTTAATTACCAGAAAA ACGTCCA-3（斜体加黑部分为Xho I酶切位点）；

（2）RT-PCR反应——以旋毛虫肌幼虫RNA为模板，进行RT-PCR扩增，PCR反应条件为反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min。