[发明专利]用汉逊酵母表达系统产生HPV45 L1蛋白的方法

权利要求书

1.一种产生HPV45 L1蛋白的方法，包括以下步骤：

a).产生表达人乳头瘤病毒45型L1(HPV45 L1)蛋白的重组汉逊酵母细胞；

b).在适于所述HPV45 L1蛋白表达的条件下培养a)中获得的重组汉逊酵母细胞；和

c).从培养物中回收并纯化所述HPV45 L1蛋白；

其中a)中通过包含以下步骤的方法产生表达人乳头瘤病毒45型L1(HPV45 L1)蛋白的重组汉逊酵母细胞：

a1)通过将包含与MOX启动子和MOX终止子可操纵地连接的SEQ ID NO:2所示的HPV45L1蛋白编码序列的外源多核苷酸插入序列示于SEQ ID NO:9的载体来构建表达构建体；

a2)用步骤a1)中获得的表达构建体转化ATCC26012汉逊酵母细胞；和

a3)用Zeocin和G418对步骤a2)中获得的汉逊酵母细胞进行筛选，获得含有拷贝数大于60的所述外源多核苷酸的重组汉逊酵母细胞；

其中b)中的培养包括以下步骤b1)和b2)：

b1)制备发酵种子液：取所述重组汉逊酵母细胞50μl接入5ml YPD培养基中，于30℃、200rpm摇床培养20-24hr，A_600nm2-5，各吸取1ml接入2瓶500ml YPD培养基中，于30℃、200rpm摇床培养20-24hr至A_600nm 15-20，作为发酵种子液待用；

b2)发酵：500ml发酵种子液加入至30L发酵罐中的发酵起始培养基，发酵体积为15L；起始搅拌转速为200rpm、空气流量0.5Nm³/hr、罐压0.5bar，发酵中控制溶氧值为20-80％；起始生长期维持25hr后，菌液A_600nm达到20，溶氧开始快速上升，开始以100ml/hr流速流加补料培养基；培养6-8hr后，菌液A_600nm达到90，停止流加，氨水调节pH值至6.0；溶氧开始回升后开始流加含12ml/L PTM1的甲醇进入诱导表达期，诱导温度设定为35℃，甲醇初始流加速率为50ml/hr，每小时取样，甲醇电极测定甲醇浓度，通过调节甲醇流加速率使甲醇浓度控制在＜5g/L；诱导10hr后下罐，4℃条件下以5000rpm离心30min收集湿菌体，-20℃冻存备用；

其中c)中的回收和纯化包括以下步骤c1)和c2)：

c1)取-20℃保存的HPV45-L1表达湿菌体，按照10ml/g湿菌体的比例加入0.9％生理盐水清洗；菌体洗涤后，按20ml缓冲液/g湿菌体加入破碎缓冲液充分溶解，使用高压匀浆破碎，破碎压力1500bar，循环破碎5-8遍，镜检破碎率＞90％；菌体破碎液在4℃条件下以10000rpm离心30min，收集上清液；

c2)经1μm过滤的菌体破碎上清液，上样于层析介质POROS XS，用0.5M～1.5M NaCl梯度洗脱，收集洗脱的HPV45L1蛋白；将初步纯化后的HPV45L1蛋白上样于层析介质Macro-Prep陶瓷羟基磷灰石，目的蛋白结合于层析介质上，用20～200mM磷酸盐浓度梯度洗脱，目的蛋白与杂质分离，收集洗脱的HPV45L1蛋白。

2.根据权利要求1的方法，其中步骤a3)中用0.5mg/ml的Zeocin和16mg/ml的G418对步骤a2)中获得的汉逊酵母细胞进行筛选。

3.根据权利要求1的方法，其中步骤a3)中所述筛选包括

1)将步骤a2)中获得的汉逊酵母细胞涂布于含0.5mg/ml Zeocin的YPD平板中，于30℃倒置培养3-7天；

2)挑取Zeocin抗性平板上长出的重组菌株单菌落，接种于5ml含0.5mg/ml Zeocin的YPD液体培养基中，于30℃、200rpm摇床培养24-48小时，至OD值达50后，以1:1000的比例转接于5ml含0.5mg/ml Zeocin的YPD液体培养基中，培养至OD值达50后，再以1:1000的比例转接于5ml含0.5mg/ml Zeocin的YPD液体培养基中，连续传10次；

3)将传至10次的重组汉逊酵母表达菌株接入5ml不含Zeocin的YPD液体培养基中，于30℃、200rpm摇床培养至OD值达50后，以1:1000的比例转接于5ml YPD液体培养基中，在不含Zeocin的YPD液体培养基中连续传5次；和

4)将获得的产物涂布在含16mg/ml G418的YPD平板，于30℃倒置培养2-3天，挑取单菌落进行拷贝数检测。