[发明专利]一种超双元载体、构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别是涉及一种培育无选择标记转基因植物的超双元载体、构建方法及其应用，更具体涉及到无选择标记基因转基因兼抗水稻条纹病毒和水稻黑条矮缩病毒转基因水稻植株的获得。 

背景技术

自从上世纪80年代转基因植物诞生以来，植物转基因工程作为提高作物品质、产量、抗胁迫能力等的有效手段之一，其发展势头始终不减，现已跃入大规模商业化生产阶段，并成为发展最快、应用潜力最大的生物技术领域之一。据国际农业生物技术应用服务组织（ISAAA）统计，从1996年转基因生物商业化以来，由最初的6个国家种植170万公顷增加至2012年29个国家种植1.7亿公顷（增加了100倍之多），超过1700万农民从中获益，使得杀虫剂的使用量减少了一半，其中20个发展中国家种植面积达到52%，为保障粮食安全和进一步减少世界某些脆弱地区的贫困做出了贡献。在中国，共有720万小农户种植了400万公顷转基因植物，涉及的植物有棉花、木瓜、白杨树、西红柿及甜椒等(Clive James,中国生物工程杂志，2012,33（2）：1-8)。 

目前用于将外源基因导入植物细胞中的方法有很多，常用方法有基因枪法和根瘤农杆菌介导法。基因枪法的优点是不受宿主细胞基因型的限制，缺点是该方法导入的外源基因拷贝数多，嵌合基因整合进宿主细胞染色体中的频率低，可同时将用于细菌筛选和再生植株筛选的标记基因同时导入。农杆菌介导法的缺点是受宿主细胞基因型限制，其优点是操作简单、转化效率较高、成本低，避免将用于细菌筛选的标记基因导入植物，只将位于同一T-DNA区内的外源目的基因和标记基因导入植物，并且紧密相连，目前主要应用于双子叶植物和少数单子叶植物的遗传转化。 

在转基因植物的获得过程中，为了便于筛选到低频率的转化事件，常将外源目的基因与易于识别的选择标记基因串联，再通过标记基因筛选低频率的转化事件。选择标记基因多为抗生素或除草剂抗性基因，随着抗性愈伤和再生植株选择过程的结束，其变为多余的基因，而其随着外源目的基因传递给转基因后代，还可引发安全性问题。选择性标记基因的存在对环境的潜在危害主要表现在：1）标记基因有可能转移到土壤微生物和其它植物，继而引起其它生物产生抗性；2）在食品上有一定的安全风险和消费心理障碍，因此，很多国家和组织都制定了相关的条款和法规，使得多数转基因作物商品化生产难以实现，因此培育无选择标记 基因的安全转基因植物已成为植物基因工程发展的趋势。 

目前常用于获得无选择标记基因植物的方法主要有位点特异性重组、转座子系统和共转化法等。位点特异性重组系统能精确的引入外源基因，但需要进行二次转化或杂交，费时、费力。利用转座子系统虽然能完整的删除选择标记基因，但需要通过有性繁殖分离目的基因和标记基因，周期长、效率低，且不稳定，难以定向优化。共转化法具有操作简便，适用范围广，基因转化效率较高等优点，被广泛的应用于水稻、烟草、油菜、大豆、玉米等植物中。农杆菌介导的共转化法就是把目的片段和选择性择标记基因分别构建于不同载体或同一载体的不同T-DNA区，期望借助于农杆菌等转化方法将选择标记基因和目的基因同时导入同一受体细胞的不同染色体上。一方面利用选择标记基因编码的性状，筛选出同时含有目的基因的细胞或再生植株。另一方面，通过转基因植株后代自交，使目的基因和选择标记基因发生分离，从而获得不携带选择标记基因的转基因阳性植株。因此，农杆菌介导的共转化法不仅可以避免将用于细菌筛选的标记导入转基因植物，而且可以通过后代自交分离剔除用于再生植株筛选的标记基因，从而获得安全的转基因植物，为转基因植物的商业化生产排除障碍。 

发明内容

基于上述目的，本发明提供了一种含有双T-DNA区的超双元载体，该载体含有两个T-DNA区，可以通过酶切位点Xho I方便、快捷的将外源目的基因或具有RNA干涉效果的发夹结构插入T-DNA1区，而选择标记基因（潮霉素抗性基因）则位于T-DNA2中。利用该载体可以直接将外源基因（结构）插入T-DNA1中，获得适合根瘤农杆菌转化单子叶植株的表达载体，既可节省人力物力财力，又提高了工作效率，重要的是可以通过T₁代转基因植株自交分离获得无抗生素标记基因的转基因安全植物，为通过植物基因工程获得可安全释放的转基因新种质提供技术支撑。 

本发明还提供超双元载体和RNA干涉载体的构建方法，为无选择标记基因植物的获得，以及抗病育种工程提供了一种新的策略和思路。