[发明专利]利用RT-LAMP技术快速检测高粱花叶病毒

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速检测高粱花叶病毒的方法，属于农业科学技术领域。

技术背景

高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus)甘蔗上的一种主要病毒病，属于马铃薯Y病毒属的甘蔗花叶病毒亚组成员。在我国广东、广西、浙江、福建等甘蔗产区普遍发生，局部地区为害严重。感病植株一般出现黄绿相间不规则的嵌纹、条斑或斑驳，尤以新叶基部症状最为明显，造成甘蔗产量及蔗茎含糖量降低。

环介导恒温核酸扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由Notomi T等在2000年发明的，是一种基于高灵敏链置换技术的恒温核酸扩增方法，其原理为：利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA poly-merase)在恒温条件(65℃左右)下保温几十分钟，即可实现核酸的扩增。反应结果可通过反应副产物焦磷酸镁白色沉淀的形成进行肉眼观察，或者通过浊度仪检测焦磷酸镁白色沉淀的混浊度来判定，也可在反应管中加入荧光染色试剂目测判定。该方法操作简单，无需特殊的仪器(PCR仪)，且此方法具有特异性强、灵敏度高等优点，是一种快捷而有效的检测方法。目前已广泛的应用于人类和动植物各种病毒、细菌、真菌、寄生虫等引起的疾病检测和快速诊断。

目前在植物病毒鉴定识别上常采用的方法有：生物学学接种实验，血清学检测，电镜观察及分子学检测。其中分子生物学方法以PCR最为常见，但是PCR费时间且需要昂贵的仪器(PCR仪)；而血清学检测方法中，较为常见的有ELISA及DIBA等，但是灵敏度不高，特异性也易收到限制，而LAMP方法很好的克服了当前的方法中存在的不足，目前尚未见到使用该方法检测甘蔗高粱花叶病毒的方法。LAMP方法既保证了检测的灵敏性和特异性，同时又简化了操作，节省了成本，为今后该病害的调查提供了一种简单而有效的方法。

发明内容

本发明提供了一种快速检测甘蔗高粱花叶病毒的方法，通过该方法可以灵敏、特异的诊断出甘蔗高粱花叶病毒。

本发明所提供的一种快速检测高粱花叶病毒的方法，是通过以下方法获得的：

1)根据NCBI已报道的高粱花叶病毒的CP蛋白的核苷酸序列，通过多序列比对选择相对保守序列，通过在线LAMP引物设计软件primerExplorer V4设计4条引物，其中包括2条外引物F3/B3和2条内引物FIP/BIP。

2)利用RNAiso Plus法提取甘蔗植株的总RNA；

3)设置不同的Mg²⁺浓度、内外引物的浓度比例以及甜菜碱的浓度，确定最佳反应体系；分别改变反应的温度进行RT-LAMP扩增反应，确定最佳的反应条件。

4)在最佳反应参数的条件下，以未感染样品作为阴性对照验证这一方法的特异性；

5)实验结果可以通过肉眼判断和1.5％的电泳检测进行验证。

6)本发明提供的引物序列如下：

F3：5-GACCATGATGGATGGAGAW-3

B3：5-AAGTCGGTCWAGTTTCGC-3

FIP：5-TCACTTTAGTGATGCAGCTGAAG-TGAAGTCCGTATCTTGGC-3

BIP：5-TGCATAATCTGCCTAAATGRTGGAG-GAACAAAGAACATTTCCTTTAAAGC-3

RT-LAMP的反应温度为61℃-63℃，反应时间为60-90min。利用电泳检测或者荧光染料检测可以检测出高粱花叶病毒。

本发明的好处是能够快速诊断甘蔗上的高粱花叶病毒，是一种简便有效的方法。

附图说明

附图1为不同温度条件下RT-LAMP结果的电泳图(M：标准分子量；1、61℃；2、63℃；3、65℃；4阴性对照)。

附图2为电泳检测高粱花叶病毒的结果(M：标准分子量；1、甘蔗花叶病毒；2、阴性对照)；

具体实施方法

实施例1，甘蔗高粱花叶病毒RT-LAMP反应条件的优化

1、引物的设计：

F3：5-GACCATGATGGATGGAGAW-3

B3：5-AAGTCGGTCWAGTTTCGC-3

FIP：5-TCACTTTAGTGATGCAGCTGAAG-TGAAGTCCGTATCTTGGC-3

BIP：5-TGCATAATCTGCCTAAATGRTGGAG-GAACAAAGAACATTTCCTTTAAAGC-3

高粱花叶病毒RT-LAMP的温度梯度实验