[发明专利]鹰嘴豆壳二孢叶枯病真菌分子检测引物及其应用

说明书

技术领域

本发明属于农作物病害检测、鉴定及防治技术的领域，更具体涉及一种鹰嘴豆壳二孢叶枯病菌分子检测引物及其应用。

背景技术

由鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei引起的鹰嘴豆壳二孢叶枯病是一种毁灭性的病害，该病于2007年首次在新疆木垒县发现，一旦发病会造成大面积的减产。目前该病害已对我国鹰嘴豆生产构成了威胁。病菌主要以土壤、种子带菌，并以菌丝体和分生孢子在落叶上越冬，翌年初夏产生新的分生孢子。分生孢子借风雨传播，到达叶面后由气孔侵入，引起初侵染。病菌侵入寄主后，经过一定时期，可以产生新的分生孢子，引起再次侵染。植株生长茂密，当天气潮湿或田间湿度大时易发病，基部接近地面叶片发病尤为严重。因此，开展鹰嘴豆壳二孢叶枯病菌检测，防止其从发病区向未发病区传播，以及在其发病初期进行诊断检测，对鹰嘴豆壳二孢叶枯病的传播与控制具有重要意义。

自从发现鹰嘴豆壳二孢叶枯病以来，各国研究人员便对其检测技术进行研究。传统的检测方法是从病残体或带病种子分离菌体，将其接种在相应培养基上，于适宜温度培养数天，再对这些菌体的形态进行观察。若产孢则继续观察分生孢子的形态特征，从菌落上挑片镜检，观察菌丝、分生孢子、分生孢子梗等形态。从而确定是否存在鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei，或者用肉眼和借助显微镜技术对发病症状进行判定是否由鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei引起的病害。传统的检测方法不仅费时、准确度低，而且要求检测人员要有丰富的经验，最重要一点是它不能满足病害防治中制定最佳防治时期及海关进出境快速检测和鉴定的需求，因此传统病原学检测方法已不能满足现代植物病理学研究的需要。

现在部分病原菌免疫血清学鉴定方法已经建立，但是特异性差，常常受到相似种的干扰，也受到抗血清质量的影响，血清学检测结果的准确性取决于抗血清的质量，单克隆抗体的专化性太强，主要用于流行学中检测菌系，通常将多种单克隆抗体混合使用，已消除过度专化的问题。目前认为在检测应用方面，多克隆抗体要优于单抗，而多克隆抗体又易与亲缘关系相近的细菌发生交叉反应。因此，常规血清学方法的应用受到了一定的限制。随着生物学技术的发展，应用PCR技术对病原菌进行特异、灵敏快速分子检测的成功例子已越来越多。国内外有学者利用基于ITS碱基序列设计引物对真菌的分子检测开展研究，但针对鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei的研究尚少。因此要对鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei进行高特异性检测，从病原菌ITS碱基序列设计高特异引物是非常必要的。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中鹰嘴豆壳二孢叶枯病菌的生物学检测方法所需周期长、准确度低等问题，提供一种鹰嘴豆壳二孢叶枯病菌分子检测引物及其应用，该特异引物：上游引物7-5f(25bp)：5′-CCCGCTACCTCTTACCCATGTCTTT-3′；下游引物7-5r(23bp)：5′-GTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGA-3′。经过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，可在鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌纯DNA，发病组织、土壤及带病种子中特异地扩增出片段长度为440bp的特异扩增产物，对鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌的快速检测。本发明所述的特异分子检测引物可被用于生产实践中感染鹰嘴豆壳二孢叶枯病的植物组织、土壤和种子中的快速、，灵敏、特异的检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为鹰嘴豆壳二孢叶枯病菌引起的病害的防治提供可靠的技术和理论依据。

本发明所述的一种鹰嘴豆壳二孢叶枯病真菌分子检测引物，该引物序列为：

上游引物7-5f25bp：5′-CCCGCTACCTCTTACCCATGTCTTT-3′

下游引物7-5r23bp：5′-GTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGA-3′。

所述鹰嘴豆壳二孢叶枯病真菌分子检测引物的用途，利用上游引物7-5f25bp：5′-CCCGCTACCTCTTACCCATGTCTTT-3′，下游引物7-5r23bp：5′-GTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGA-3′从鹰嘴豆壳二孢叶枯病真菌上特异扩增出440bp的产物。

本发明所述的鹰嘴豆壳二孢叶枯病真菌分子检测引物及其应用，包括下列步骤：

(1)鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei的分离、纯化，采用常规分离真菌的方法对其进行分离，采用单孢分离进行纯化；